李 文，易进海，刘 芳，唐小龙

(1.泸州医学院药学院，四川泸州 646000;2.四川省中医药科学院，四川成都 610041; 3.成都中医药大学药学院，四川成都 610075)

0 引言

金银花(Flos Lonicerae Japonicae)为忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb)的干燥花蕾或带初开的花，其性味甘寒，归肺、心、胃经，具有清热解毒、凉散风热等功能，常用于痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒、温病发热诸症［1］.金银花现代饮片是根据“中药煮散”理论而研发的新型中药饮片，其目的是在不改变金银花药性、药效的同时，尽可能减少饮片的剂量和煎药时间，以提高中药饮片的利用率［2］.本研究通过对金银花饮片和金银花现代饮片RP-HPLC指纹图谱的对比研究，分析两者品质是否存在差异，进而为金银花现代饮片的临床应用提供实验依据.

1 仪器、药材与试药

1.1 仪 器

实验所用仪器包括:Agilent 1200型高效液相色谱仪(包括四元泵、DAD检测器、柱温箱、自动进样器、工作站)，Agilent Eclipse XDB C18色谱柱(250× 4.6 mm，5 μm)，AUW220D型电子天平(日本岛津公司)，KQ-100型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)，Millipore Milli-Q Integral 3超纯水机，3K15高速离心机(德国Sigma公司).

1.2 药 材

实验所用药材包括:不同产地的金银花饮片，并由成都中医药大学中药鉴定与药用植物学教研室蒋桂华教授鉴定为忍冬科多年生半常绿木质藤本忍冬的干燥花蕾或带初开的花;金银花现代饮片为本实验室自制(取金银花粗粉，按0.2 mL/g均匀喷水，充分混匀后制得软材，塑制法挤压成型，中低火微波(750 W，频率2 450 MHz)干燥4 min，取出即得.

1.3 试 药

实验所用试药包括:绿原酸对照品(批号，110753－200413，中国药品生物制品检定所)，甲醇为色谱纯(Fisher公司)，超纯水，其他试剂均为分析纯.

2 方法与结果

2.1 色谱条件

实验所用的色谱条件为:色谱柱，Eclipse XDB C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，A相为0.4%磷酸溶液，B相为乙腈;梯度洗脱程序为，0～20 min (97%～90%A)，20～45 min(90%～76%A)，45～55 min(76%～60%A)，55～60 min(60%～97% A);检测波长238 nm，色谱柱温度35℃，流速1.0 mL/min，运行时间60 min.

2.2 参照物溶液制备

参照物溶液的制备方法为:取绿原酸对照品适量，精密称定，加甲醇配制成0.0394 mg/mL的对照品溶液.

2.3 供试品溶液制备

供试品溶液的制备方法为:取金银花饮片粗粉0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，密塞，称定重量，浸泡20 min，超声处理30 min，放冷，再称定重量，用甲醇补足损失的重量，摇匀，高速离心(12 000 rpm)5 min，取上清液，供HPLC分析用.另外，取金银花现代饮片粗粉约0.5 g，同法制备金银花现代饮片供试品溶液.

2.4 色谱指纹图谱实验方法学验证

2.4.1 专属性考察.

分别取甲醇溶液和绿原酸对照品溶液注入高效液相色谱仪进行分析，其图谱如图1所示.

图1 甲醇图谱(A)和绿原酸图谱(B)

由图1可知，绿原酸的保留时间约为22 min，且甲醇在对照品保留时间一致的位置上无吸收峰，说明本实验的专属性良好.

2.4.2 仪器精密度.

取同一份供试品溶液，连续进样6次，以绿原酸的峰面积计算其RSD(%)为0.50，其全谱的相似度(中位数相关系数法)分别为，0.999、0.999、0.997、0.999、0.997、0.998.实验结果表明，仪器精密度良好.

2.4.3 稳定性.

取同一份供试品溶液，分别于，0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h，进样，以绿原酸的峰面积计算其RSD (%)为0.78，其全谱的相似度(中位数相关系数法)分别为，0.999、0.998、0.997、0.999、0.996、0.998.实验结果表明，样品在24h内稳定.

2.4.4 重复性.

取同一批号的供试品5份，按供试品溶液的制备和检测方法进行测定，以绿原酸的峰面积计算其RSD(%)为1.36，其全谱的相似度(中位数相关系数法)分别为，0.995、0.991、0.995、0.993、0.990.实验结果表明，方法的重复性良好.

2.5 色谱指纹图谱建立和辨认

2.5.1 色谱峰的定位和参照物的选择.

通过对照品实验，鉴别金银花HPLC指纹图谱第2号色谱峰为绿原酸，该峰为指纹图谱中峰面积积分值最大、最稳定的一个峰.此外，绿原酸为2010年版《药典》(一部)金银花项下规定的指标成分［3］，故本研究选择绿原酸作为参照物.

2.5.2 共有色谱峰的相对保留时间和相对峰面积.

从10批金银花饮片HPLC图谱的15个色谱峰中，选择9个峰作为共有色谱峰.共有色谱峰的相对保留时间如表1所示，相对峰面积如表2所示.

表1 10批金银花饮片共有色谱峰相对保留时间

表2 10批金银花饮片共有色谱峰相对峰面积

从表1和表2数据可知，10批金银花饮片共有色谱峰相对保留时间的RSD(%)＜3.

同样，从10批金银花现代饮片HPLC图谱的15个色谱峰中，选择9个峰作为共有色谱峰.共有色谱峰的相对保留时间见表3，相对峰面积见表4.

表3 10批金银花现代饮片共有色谱峰相对保留时间

表4 10批金银花现代饮片共有色谱峰相对峰面积

从表3和表4数据可知，10批金银花现代饮片共有色谱峰相对保留时间RSD(%)＜3.

2.5.3 相似度评价.

相似度评价采用国家药典委员会编制的2004A版“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”分析软件，计算10批金银花饮片和金银花现代饮片的相似度，结果如图2所示.

图2 10批金银花饮片指纹图谱(A)和10批金银花现代饮片指纹图谱(B)

计算数据表明:10批金银花饮片的相似度依次为，0.980、0.943、0.983、0.994、0.993、0.994、0.949、0.985、0.918、0.995;10批金银花现代饮片的相似度依次为，0.989、0.995、0.978、0.937、0.995、0.993、0.989、0.995、0.918、0.920.实验结果表明，10批金银花饮片与10批金银花现代饮片其相似度均大于0.90，具有较高的相似度.经软件处理，本研究得到的金银花饮片和金银花现代饮片共有模式如图3所示.

图3 10批金银花饮片共有模式(A)和10批金银花现代饮片共有模式(B)

3 讨论

在研究过程中，我们通过查阅文献，并经比较后确定本实验的色谱条件［4－7］为:采用乙腈—0.4%磷酸水溶液二元梯度法，A相为0.4%磷酸溶液，B相为乙腈;梯度洗脱程序为，0～20 min(97%～90% A)，20～45 min(90%～76%A)，45～55 min(76%～60%A)，55～60 min(60%～97%A);检测波长238 nm，色谱柱温度35℃，流速1.0 mL/min，运行时间为60 min.在该色谱条件下，金银花饮片和金银花现代饮片中各组分得到较好地分离，并且在60 min内各组分全部出峰.

金银花现代饮片是根据“中药煮散”理论研发的新型中药饮片，其饮片的使用量和煎药时间与传统饮片相比明显减少，中药饮片的利用率显著提高，且其指纹图谱与金银花饮片的指纹图谱无明显差异.实验表明，金银花现代饮片具有较好的发展及应用前景.

［1］张廷模.中药学［M］.北京:高等教育出版社，2002.

［2］孙守祥.中药汤剂的历史发展与未来改进探讨［J］.时珍国药研究，1997，8(2):169－170.

［3］国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)［M］.北京:化学工业出版社，2010.

［4］杨雪萍，袁红英，李峰.不同产地金银花药材高效液相指纹图谱的研究［J］.江西中医学院学报，2009，21(4):38－40.

［5］王跃飞，文红梅，贺祝英.金银花药材HPLC指纹图谱研究［J］.南京中医药大学学报，2006，22(2):128－129.

［6］郑霞，刘军，杨永波，等.金银花药材指纹图谱的建立［J］.黑龙江中医药，2008，4(6):42－43.

［7］熊艳.金银花不同干燥技术HPLC指纹图谱研究［J］.中国中药杂志，2009，34(8):1015－1017.