倪斌 胡华军

[摘要] 目的：制备CdTe/ZnSe核壳量子点标记卵清白蛋白（OVA）探针OVA-CdTe/ZnSe，并检测其特异性荧光示踪作用。方法：将CdTe/ZnSe核壳量子点与OVA偶联制备荧光探针，通过凝胶电泳和光谱分析鉴定偶联效果；然后示踪OVA致敏的小鼠外周血嗜碱粒细胞（BASO）表面IgE高亲和力受体FcεRI。结果：偶联OVA后的量子点分子量增加，荧光增强且荧光峰位从628 nm红移至635 nm。通过激光共聚焦显微镜能清晰观测到OVA-CdTe/ZnSe探针对BASO表面IgE-FcεRI复合物的荧光标记。结论：OVA-CdTe/ZnSe探针能示踪OVA特异性IgE-FcεRI复合物，此探针在OVA致敏动物模型的特异性IgE检测中具有一定应用价值。

[关键词] CdTe/ZnSe核壳量子点；免疫荧光标记；鸡卵清白蛋白；IgE

[中图分类号] R392-3[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2011）11（c）-019-03

Preparation and fluorescence-imaging application of OVA-CdTe/ZnSe core/shell quantum dots

NI Bin, HU Huajun*

Department of Pharmacy, College of Life Science, China Jiliang University, Zhejiang Province, Hangzhou310018, China

[Abstract] Objective: To establish a method to detect the IgE-FcεRI on BASO cells by using CdTe/ZnSe core/shell quantum dots(QDs) immuno-fluorescence labeling technology. Methods: CdTe/ZnSe core/shell QDs were coupled to the OVA with N-hydroxysuccinimide (NHS). After confirmation by agarosegel electrophoresis method and spectra analysis, the coupled product (OVA-CdTe/Znse) was used to detect the IgE-FcεRI on BASO cells. Results: Spectra analysis showed that the fluorescence intensity of OVA-CdTe/Znse was enhanced and the emission peak underwent a red-shift from 628 nm to 635 nm. Confocal fluorescence microscopy further showed that OVA-IgE-FcεRI on BASO cells characterized by the red fluorescence. Conclusion: OVA-CdTe/Znse fluorescence probes can effectively recognize IgE-FcεRI on BASO cells, which can be used in allergic animal model for detecting OVA specific IgE.

[Key words] CdTe/ZnSe core/shell quantum dots; Immuno-fluorescence labeling; OVA; IgE

支气管哮喘（bronchial asthma，简称哮喘）属于过敏性疾病的一种，其发病机制复杂，目前全球约有3亿哮喘患者，被WHO列为四大顽症之一。鉴于人体试验的局限性，对哮喘的干预研究往往通过建立与人相似症状的动物模型来进行。常用的哮喘动物（大鼠、小鼠、豚鼠）模型都存在不足之处。如豚鼠致敏后的变态反应与人类的不同，其更多由IgG介导；大鼠、小鼠制作的哮喘模型能产生特异性IgE，可临床指征不明显[1]。因此有必要寻找和开发新的哮喘动物模型。但哮喘新模型的开发还面临一个具体问题，即除大鼠、小鼠、豚鼠外的其他实验动物在卵清白蛋白（OVA）致敏后，因缺乏血清OVA特异性IgE的检测试剂，使致敏效果难以判断，这也阻碍了新模型的开发[2]。根据外周血嗜碱粒细胞（BASO）表面的IgE高亲和力受体FcεRI的密度与血清IgE水平有较好的相关性[3]。可研制一种OVA荧光探针，用于对OVA致敏动物的外周血BASO细胞表面IgE高亲和力受体FcεRI进行荧光标记，通过其荧光示踪可知该动物的致敏效果。量子点（quantum dots，QDs）荧光标记技术是近些年发展起来的一项新型荧光示踪技术。本研究利用巯基丁二酸为表面修饰剂合成的水溶性CdTe/ZnSe核壳QDs与OVA偶联，制备OVA-CdTe/ZnSe探针，用于对OVA致敏的小鼠外周血BASO细胞表面IgE高亲和力受体FcεRI进行荧光标记。

1 材料和方法

1.1 试剂与仪器

巯基丁二酸（Mercaptosuccinic acid，MSA）、N-羟基琥珀酰亚胺（N-hydroxysuccinimide，NHS）、卵清白蛋白（OVA）、牛血清白蛋白（BSA）和佐剂液态铝（Sigma-Aldrich公司）；碲粉（Te）、硒粉（Se）、氯化镉（CdCl2）、硼氢化钠（NaBH4）、氧化锌（ZnO）（中国医药集团上海化学试剂公司）；C57BL/6小鼠（6~8周龄雄性，购自浙江大学实验动物中心）；去离子超纯水处理系统（Milli-Q，Millipore公司）；凝胶成像系统（购自Gene Genius）；紫外-可见分光光度计（UV-2550，Shimadzu公司）；荧光光谱仪（F-2500，Hitachi公司）；激光共聚焦显微镜（Leica TCS-SP，Leica公司）。

1.2 方法

1.2.1 OVA-CdTe/ZnSe探针的制备MSA包覆的CdTe/ZnSe核壳QDs的制备方法见参考文献[4-5]。将CdTe/ZnSe与OVA进行共价连接，即首先用NHS将QDs表面配体的羧基活化，然后再与蛋白质表面氨基反应形成酰胺键，即得CdTe/ZnSe与OVA的偶联物。具体方法：在1 ml水（NaOH调pH=8）中，加入200 μl巯基丁二酸修饰的CdTe/ZnSe溶液（OD488值为0.25）和50 μl 0.2g/L NHS，室温活化10 min后，再加入100 μl OVA （0.1 mg/ml），室温条件下旋转混匀30 min，然后将CdTe/ZnSe与OVA偶联产物进行离心纯化即得OVA-CdTe/ZnSe探针，4℃保存备用，使用时以水溶解。

1.2.2 OVA-CdTe/ZnSe探针的凝胶电泳和光谱检测琼脂糖凝胶电泳分析CdTe/ZnSe与OVA偶联前后的分子大小变化，其电泳条件：琼脂糖凝胶浓度0.8%，电压80 V，电泳时间15 min，采用凝胶成像系统成像分析。UV-2550紫外-可见分光光度计测量CdTe/ZnSe与OVA偶联前后的吸收光谱变化，以水（pH=8）作空白校正基线。F-2500荧光光谱仪测量CdTe/ZnSe与OVA偶联前后的荧光发射光谱的变化，激发波长为460 nm，以水调零。

1.2.3 OVA-CdTe/ZnSe探针标记嗜碱粒细胞表面IgE高亲和力受体FcεRI 分别于第0、14天对C57BL/6小鼠腹腔注射致敏液0.2 ml（0.08%的OVA 0.1 ml与等体积佐剂液态铝混合）致敏；第15天眼球采血，Percoll密度梯度离心法分离外周血BASO细胞。将BASO细胞于含有0.3%Triton-100的PBS作用10 min，0.01 mol/L PBS洗3次；于含有10%牛血清白蛋白（BSA）的PBS中封闭20 min。滴加OVA-CdTe/ZnSe探针（用含10%BSA的PBS稀释，对照滴加BSA-CdTe/ZnSe和CdTe/ZnSe），置于湿盒中，37℃，30 min。先0.01 mol/L PBST洗3次，然后0.01 mol/L PBS洗3次；缓冲甘油封片。在激光共聚焦显微镜下成像，激发波长为488 nm。

2 结果

2.1 CdTe/ZnSe与OVA偶联效果的鉴定

CdTe/ZnSe及其与OVA偶联物的表面带有大量的羧基负电荷，在电场中会向正极泳动。图1为CdTe/ZnSe与OVA偶联物的电泳结果。如图2所示，在400~700 nm范围内，CdTe/ZnSe与OVA偶联前后的吸收光谱随波长变化不明显，而偶联后的荧光略有增强，且荧光峰位从628 nm红移至635 nm。

2.2 OVA-CdTe/ZnSe探针荧光示踪OVA特异性IgE-FcεRI复合物

在激光共聚焦显微镜视野下，能清晰观测BASO表面IgE-FcεRI复合物被OVA-CdTe/ZnSe探针标记后发出的红色荧光（图3-A），而BSA-CdTe/ZnSe和CdTe/ZnSe因不能与细胞膜结合而无明显荧光（图3-B、3-C）。

3 讨论

QDs是一种由Ⅱ~Ⅵ族或Ⅲ~Ⅴ族元素组成的尺寸在1~100 nm之间稳定的微小晶粒，受激后可以发射荧光[6]。QDs的激发波长范围可以涵盖整个光谱，用同一波长的光可以激发不同的QDs，同时获得多种颜色荧光，方便用于多目标分子的多色标记，并且核壳结构QDs的表面经过修饰，其毒性要比有机荧光染料弱得多，很有希望成为新一代生物荧光标记物[7]。本研究合成的CdTe/ZnSe核壳QDs不需经过任何后续处理，荧光产率高达44%，并且ZnSe外壳及MSA的修饰大大提高了原始CdTe核的稳定性和生物相容性[4-5]。将CdTe/ZnSe与OVA共价连接后，复合物粒径和相对质量增大，因此导致电泳迁移率降低。同时与CdTe/ZnSe的电泳条带相比，CdTe/ZnSe与OVA偶联物的荧光条带展宽，是由于QDs与蛋白的偶联比不固定所致。CdTe/ZnSe与OVA偶联后会对CdTe/ZnSe的荧光性质产生一定的影响，其原因可能由于蛋白质对量子点的表面修饰，而且量子点经NHS作用与蛋白质经过共价连接，一个蛋白可能结合多个量子点，拉近量子点之间距离，导致量子点之间的偶极相互作用增强，使其Stokes位移增大，荧光峰位红移[8-9]。这些都表明CdTe/ZnSe与OVA偶联成功，经纯化后即获得OVA-CdTe/ZnSe探针。另外本研究采用Percoll密度梯度离心法分离OVA致敏小鼠的外周血BASO细胞，致敏小鼠所产生的OVA特异性IgE可与BASO细胞表面FcεRI结合，形成FcεRI-IgE复合物，而OVA又能与OVA特异性IgE结合，经OVA-CdTe/ZnSe探针标记后即可在BASO细胞表面形成了FcεRI-IgE-OVA-CdTe/ZnSe复合物，通过荧光成像可清晰显示出BASO细胞表面FcεRI的密度。由于OVA-CdTe/ZnSe探针识别OVA特异性IgE介导连接FcεRI，因此应用上不受物种限制，尤其在开发哮喘新动物模型的特异性IgE检测方面具有很好的应用价值。

[参考文献]

[1]Shin YS, Takeda K, Gelfand EW. Understanding asthma using animal models [J]. Allergy Asthma Immunol Res,2009,1(1):10-18.

[2]Kirschvink N, Reinhold P. Use of alternative animals as asthma models [J]. Curr Drug Targets,2008,9(6):470-484.

[3]Malveaux FJ, Conroy MC, Adkinson NF Jr, et al. IgE receptors on human basophils. Relationship to serum IgE concentration [J]. J Clin Invest,1978,62(1):176-181.

[4]Fu T, Qin HY, Hu HJ, et al. Aqueous synthesis and fluorescence-imaging application of CdTe/ZnSe core/shell quantum dots with high stability and low cytotoxicity [J]. J Nanosci Nanotechnol,2010,10(3):1741-1746.

[5]胡华军,付涛,张明洲,等.CdTe/ZnSe核壳量子点免疫层析试纸条检测克伦特罗的研究[J].分析化学,2010,38(12):1727-1731.

[6]Nirmal M, Brus L. Luminescence photophysics in semiconductor nanocrystals [J]. Acc Chem Res,1999,32(5):407-414.

[7]Jaiswal JK, Mattoussi H, Mauro JM, et al. Long-term multiple color imaging of live cells using quantum dot bioconjugates [J]. Nat Biotechnol,2003,21(1):47-51.

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[9]Dollefeld H, Weller H, Eychmuller A. Particle-particle interactions in semi-conductor nanocrystal assemblies [J]. Nano Letters,2001,1(5):267-269.

（收稿日期：2011-10-24）

[基金项目] 浙江省实验动物科技计划项目（编号：2009F80011）。