郭兴凤，吴欣欣，薛园园，鲁亚楠

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

碱性蛋白酶水解豌豆蛋白及其产物抗氧化活性研究

郭兴凤，吴欣欣，薛园园，鲁亚楠

（河南工业大学 粮油食品学院，河南 郑州 450001）

采用碱性蛋白酶（Alcalase）水解豌豆蛋白，对不同条件下制备的豌豆蛋白酶水解产物DPPH·清除率进行了研究，在单因素试验基础上采用响应面分析方法优化酶水解条件，得到最佳酶解工艺条件为：酶解温度56.5℃，酶解时间3.2 h，pH6.1，加酶量3.0%，底物浓度3.0%，在此条件下，碱性蛋白酶水解产物对DPPH·的清除率为47.83%.

碱性蛋白酶；豌豆蛋白质；酶水解；响应面方法；DPPH自由基

0 引言

抗氧化剂对抵御人体内活性氧危害起着重要的作用，活性氧是人体内细胞有氧呼吸过程中产生的一种有害物质[1].适当摄入具有抗氧化活性的物质可以降低人体内自由基水平，防止脂质过氧化，有助于机体抵御疾病.目前具有抗氧化活性的物质有很多种，肽类物质是最有前途的一种，可通过蛋白质酶解技术进行制备.近年来，国外学者已从多种食物蛋白如大豆蛋白、肉类蛋白、乳酪蛋白，海洋蛋白、废弃蛋白资源等的酶解液中分离出具有抗氧化活性的肽片段[2].

豌豆是我国种植的豆类之一，主要用作制备淀粉，对豌豆蛋白酶水解的研究较少，而将豌豆蛋白酶解得到生物活性肽是进一步开发应用豌豆蛋白的途径之一.本研究采用制备淀粉的副产物豌豆蛋白粉为原料，用碱性蛋白酶进行水解，在单因素试验的基础上，利用响应面分析法（Response Surface Methodology，RSM）对豌豆蛋白酶解条件进行优化，为豌豆蛋白多肽的开发利用提供试验基础和数据.

1 材料和方法

1.1 原料和试剂

豌豆蛋白粉：蛋白质含量67.38%，山东健源食品有限公司；碱性蛋白酶：标称活力单位2.4 AU/g，Novo Nordisk；其他试剂均为分析纯.

1.2 主要设备

722s可见光分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；CHA—S气浴恒温振荡器：金坛市华锋仪器有限公司；SHZ—88水浴恒温振荡器：江苏省金坛市医疗仪器厂；HH—S型数显恒温水浴锅：巩义市英峪予华仪器厂.

1.3 分析方法

1.3.1 豌豆蛋白粉中各组分的测定

粗蛋白含量的测定参照GB/T5009.5-2010；水分的测定参照GB/T5009.3-2010；灰分的测定参照GB/T5009.3-2010；粗脂肪测定参照 GB/T5009.3-2010；NSI值的测定参照GB5511-85附录.

1.3.2 豌豆蛋白的酶水解

称取一定量的豌豆蛋白粉，加入预热的缓冲溶液和蛋白酶，混匀，放入气浴恒温振荡器中振荡水解，水解完成后90℃加热10min灭酶，之后立即冷却至室温.将酶解液定容，过滤，取滤液测定DPPH·的清除率.每个试验点重复3次，试验结果用平均值±偏差表示.

1.3.3 DPPH·清除能力测定方法

参照Teng等[3]的方法.配制浓度为l×l0-4mol/L DPPH·无水乙醇溶液，避光保存.取2 mL样品与2 mL DPPH·无水乙醇溶液混合，振荡均匀，室温避光反应30min，517 nm处测定吸光值Ai.空白组以等体积无水乙醇溶液代替DPPH·溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液.DPPH·的清除率计算公式为：

式中：A0为对照组吸光度；Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度.

1.3.4 试验设计

在单因素试验的基础上，以酶水解温度、pH值、酶水解时间3个因素为自变量（分别以A、B、C表示），以酶解产物的DPPH·清除率为响应值，设计了3因素3水平共15个试验点的响应面分析试验，每个试验因素水平的选取根据单因素试验确定.

2 结果与分析

2.1 豌豆蛋白粉的组成（表1）

表1 豌豆蛋白粉的主要组成成分 %

2.2 各因素对豌豆蛋白酶水解产物DPPH·清除率的影响

2.2.1 加酶量（E/S）对豌豆蛋白酶解产物 DPPH·清除率的影响

在底物浓度为 6.0%，pH值为 7.0，酶解温度50.0℃，酶解时间3.0 h的条件下，考察加酶量对DPPH·清除率的影响，结果见图1.

图1 加酶量（E/S）对酶解产物DPPH·清除率的影响

由图1可以看出，当加酶量在1.0%～3.0%的范围内，随着加酶量的增加，酶解产物的自由基清除率不断增大，加酶量在3.0%时DPPH·清除率达到最大，加酶量超过3.0%以后，随着加酶量的增加酶解产物自由基清除率反而降低.这是因为在一定的底物浓度下，当加酶量较低时，酶可能被饱和，能与底物全部结合，故加酶量越高，水解效果相应就会越好，清除率越高.随着加酶量的继续增加，反应体系中酶浓度过高，导致酶与酶之间产生竞争性抑制，以致抗氧化肽的生成量减少[4].或者酶解过程中产生了促氧化物质，从而降低了酶解产物的清除率[5].

2.2.2 底物浓度对豌豆蛋白酶解产物DPPH·清除率的影响

在加酶量为3.0%，pH 7.0，酶解温度50.0℃，酶解时间3.0 h的条件下，考察底物浓度对DPPH·清除率的影响，结果见图2.

图2 底物浓度对酶解产物DPPH·清除率的影响

由图2可以看出，当底物浓度为3.0%时，DPPH·清除率最大，之后又随着底物浓度的增加而降低.当底物浓度相对较低时，酶分子与豌豆蛋白结合速度较慢，酶水解产物的DPPH·清除率较低.随着底物浓度增加，酶分子与豌豆蛋白接触机会增多，水解易于进行，故水解产物的DPPH·清除率增加.但当底物浓度在3.0%～6.0%的范围内增加时，DPPH·清除率反而下降，这是因为随着底物浓度的继续增大，底物分散困难，较多的底物相互包埋[6]，且反应产物浓度过大抑制水解的继续进行，反应难度加大，因此豌豆蛋白酶解物的DPPH·清除率降低.

2.2.3 pH值对豌豆蛋白酶解产物DPPH·清除率的影响

在加酶量为3.0%，底物浓度为3.0%，酶解温度50.0℃，酶解时间3.0 h的条件下，考察pH值对DPPH·清除率的影响，结果见图3.

图3 pH值对酶解产物DPPH·清除率的影响

由图3可以看出，当 pH值小于6.4时，DPPH·清除率随着pH值的增大而增大，pH值超过6.4以后，DPPH·清除率随着pH值的增大而逐渐下降.这是由于每种蛋白酶都有不同的最佳pH值范围，且受底物的影响，偏离了这个范围，不利于酶促反应的进行.同时改变pH值大小，溶液中H+浓度发生改变，最终影响碱性蛋白酶分子和底物的解离状态[7]，影响酶解的效果，导致清除率变化.

2.2.4 酶解时间对豌豆蛋白酶解产物DPPH·清除率的影响

在加酶量为3.0%，底物浓度为3.0%，pH值为6.4，酶解温度50.0℃的条件下，考察酶解时间对DPPH·清除率的影响，结果见图4.

图4 酶解时间对酶解产物DPPH·清除率的影响

由图4可以看出，使用碱性蛋白酶水解，酶解时间在1.0～3.0 h内，随着酶解时间的增加，清除率增加，酶解时间超过3.0 h以后，再延长酶解时间，清除率反而下降.DPPH·清除率在3.0 h处达到最大.这是因为蛋白酶水解蛋白质通常是从蛋白质分子的外部进行水解，当底物和蛋白酶量达到一定时，蛋白质将会逐步被水解成较小的肽段，而且特定的氨基酸残基一般存在于强自由基清除率的肽段中，随着水解的进行，从蛋白质序列上水解下来的强自由基清除率的肽段又被进一步水解，从而丧失活性[8].

2.2.5 酶解温度对豌豆蛋白酶解产物DPPH·清除率的影响

在加酶量为3.0%，底物浓度为3.0%，pH值6.4，酶解时间3.0 h的条件下，以DPPH·清除率为指标，考察酶解温度对DPPH·清除率的影响，结果见图5.

由图5可以看出，在酶解温度45.0～55.0℃范围内，随着酶解温度的升高，酶解产物的DPPH·清除率显著增加，在55.0℃时DPPH·清除率达到最大.这是因为温度较低时水解速度较慢，因此在一定的温度范围内，酶解速度随着温度的升高而增加.酶解温度达到55.0℃之后，DPPH·清除率反而随着酶解温度的升高降低.出现这种现象的原因是酶只有在特定的温度下，才能保持最佳的活性构象.酶解温度过高时，酶分子吸收过多的能量，会引起酶分子结构中次级键的解体，导致酶蛋白变性，从而使酶活性降低甚至丧失活性，所以酶解温度达到55℃后，清除率反而降低.

图5 酶解温度对酶解产物DPPH·清除率的影响

2.3 碱性蛋白酶水解豌豆蛋白条件的优化

在单因素试验的基础上，固定加酶量3.0%，底物浓度 3.0%，以酶解温度（A）、pH 值（B）、酶解时间（C）为变量，酶解产物的 DPPH·清除率为响应值，设计3因素3水平的响应面试验来拟合因素和指标（响应值）之间的函数关系，采用响应面分析法（Response Surface Methodology，RSM）寻求酶解最优工艺参数.试验安排和结果见表2[9].

表2 响应面分析试验设计和结果

以DPPH·清除率为响应值，经回归拟合后，各试验因子对响应值的影响可用如下函数表示：

Y=-268.06+3.54A+68.34B+4.89C-0.03A2-5.59B2-2.30C2-0.06AB+0.08AC+0.91BC（此方程为实际值方程），

式中：Y为DPPH·清除率；A为酶解温度；B为pH值；C为酶解时间.

根据回归方程作出不同因子的响应曲面图见图6.

运用Design-Expert 6.0软件对15个试验点的响应值进行回归分析，碱性蛋白酶水解豌豆蛋白回归方程的方差分析如表3所示.

从表3可见，本试验所建立的二次多项式模型具有高度的显著性（p＜0.000 1）；B、A2、B2、C2对清除率的影响显著，表明在碱性蛋白酶水解豌豆蛋白过程中，pH值、酶解温度的二次方、pH值的二次方、酶解时间的二次方对清除率有显著影响；失拟项在α=0.05水平上不显著.回归方程的决定系数为0.994 4，校正决定系数为0.984 4，说明该模型能解释98.44%响应值的变化，仅有总变异的1.56%不能用此模型来解释，说明该模型拟合程度良好.

对回归方程进行分析，得出最佳的工艺条件为：酶解温度56.5℃，酶解时间3.2 h，pH值为6.1，加酶量为 3.0%，底物浓度为3.0%，DPPH·清除率预测值为47.55%.采用以上所得DPPH·清除率最佳水解条件进行水解，重复3次，测得碱性蛋白酶解物DPPH·的清除率（47.83±0.45）%，证明了最佳提取条件的可靠性.

3 结论

以碱性蛋白酶水解豌豆蛋白粉，响应面方法优化得到的碱性蛋白酶解物清除DPPH·清除率的最佳工艺条件为：酶解温度56.5℃，酶解时间3.2 h，pH值为6.1，加酶量为3.0%，底物浓度为3.0%，在此条件下豌豆蛋白的碱性蛋白酶水解产物的DPPH自由基的清除率（47.83±0.45）%.

表3 回归方程的方差分析

图6 响应面曲面图

［1］Noipa T，Srijaranai S，Tuntulani T，et al.New approach for evaluation of the antioxidant capacity based on scavenging DPPH free radical in micelle systems［J］ .Food ResearchInternational，2011，44：798-806.

［2］Hwang J Y，Shyu Y S，Wang Y T，et al.Antioxidative properties of protein hydrolysate from defatted peanut kernels treated with esperase［J］ .LWT-Food Science and Technology，2010，43：285-290.

［3］Teng D，Fang Y，Song X，et al.Optimization of enzymatic hydrolysis parameters for antioxidant capacity of peptide from goat placenta［J］.Food and Bioproducts Processing，2011，89：202-208.

［4］刘秀红，张东杰.响应面分析法优化大豆抗氧化肽水解条件的研究［J］.黑龙江八一农垦大学学报，2009，21（5） ：44-49.

［5］周雪松，赵谋明，林伟锋，等.Alcalase酶解鸡肉蛋白及产物的自由基清除活性［J］.华南理工大学学报：自然科学版，2006，34（3）：117-122.

［6］王若兰，杨壮，周菲.中性酶从米糠中制取抗氧化性活性肽的研究［J］.河南工业大学学报：自然科学版，2008，29（6）：36-38.

［7］王斌，于春光，罗红宇.赤魟鱼肉蛋白酶解产物的制备及抗氧化活性研究［J］.中国食品学报，2010，10（4） ：114-115.

［8］付刚.猪骨胶原多肽的制各及其抗氧化性研究［D］.雅安：四川农业大学，2006.

［9］郭兴凤.响应面分析法在菜籽蛋白酶水解研究中的应用［J］.郑州工程学院学报，2002（4） ：19-21.

STUDY ON PEA PROTEIN HYDROLYSIS BY USING ALCALASE AND ANTIOXIDANT ACTIVITY OF HYDROLYZATE THEREOF

GUO Xing-feng,WU Xin-xin,XUE Yuan-yuan,LU Ya-nan
（School of Food Science and Technology,Henan University of Technology,Zhengzhou 450001,China）

In this paper,we used alcalase as catalyst to hydrolyze pea protein,and studied the DPPH·scavenging rate of the hydrolyzate of the pea protein prepared under different conditions.The hydrolysis conditions were optimized by response surface methodology on the basis of single factor experiments,and the optimized conditions were as follows:hydrolysis temperature 56.5℃,time 3.2 h,pH 6.1,alcalase content 3.0%(W/W),and substrate concentration 3.0%(W/V).Under the conditions,the DPPH·scavenging rate of the hydrolyzate was up to 47.83%.

alcalase； pea protein； enzymatic hydrolysis； response surfacemethodology； DPPH free radical

TS 201.1

B

CNKI:41-1378/N.20120208.0844.002

1673-2383（2012）01-0006-05

http://www.cnki.net/kcms/detail/41.1378.N.20120208.0844.002.html

网络出版时间：2012-2-8 08:44:47AM

2011-07-20

郭兴凤（1965-），女，河南封丘人，教授，研究方向为蛋白质资源开发与应用.