于姗姗，王青林，孟宪亮，董云伟，董双林

（1.中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003；2.厦门大学海洋与环境学院，福建厦门361005）

盐度骤变对仿刺参hsp70及hsp90基因表达的影响＊

于姗姗1，王青林1，孟宪亮1，董云伟2＊＊，董双林1

（1.中国海洋大学海水养殖教育部重点实验室，山东青岛266003；2.厦门大学海洋与环境学院，福建厦门361005）

为研究夏季暴雨导致的养殖池塘盐度变化对仿刺参（Apostichopus japonicus）生理的影响，在实验室内模拟野外盐度变化，采用半定量RT－PCR的方法研究了其hsp70、hsp90a及hsp90b基因的表达。实验中，盐度先以每6 h降2.5的速度由30降至20；保持96 h后，再以同样的速度由20升至30，随后在盐度为30条件下保持96 h。在盐度变化过程中随机取样。hsp70和hsp90b基因在盐度降至20后表达量开始显著升高（P＜0.05），hsp90a基因在盐度降至22.5时表达量开始显著升高（P＜0.05）；但保持在盐度为20条件下，3个基因的表达量均逐渐降低至初始值。在之后的盐度升高及恢复阶段，3个基因表达量均有先升高后降低的趋势，表明hsp70、hsp90a和hsp90b基因是仿刺参在盐度胁迫下的重要响应因子。

仿刺参；盐度；热休克蛋白

作为最重要的生态因子之一，盐度对仿刺参的行为、生长、繁殖有着直接的影响［1－3］。目前虾池养殖已经成为仿刺参养殖的重要模式［4－5］。在虾池养殖过程中，养殖池塘水体交换由自然潮汐决定，一般情况下盐度会维持在相对稳定的范围，但在夏季暴雨过后盐度会骤降至20左右，并维持数天［6］。这种大范围的盐度变化，必然会对仿刺参带来消极的影响，严重时会导致仿刺参的大规模死亡，给仿刺参养殖业造成巨大的损失。有研究表明仿刺参适宜生长的盐度为20～35，最适生长盐度为25～30［7］。盐度骤降会引起体腔液渗透压的改变从而产生渗透压胁迫，渗透压胁迫使细胞内离子代谢受到严重影响，进一步导致蛋白合成紊乱以及蛋白损伤［8－9］。因此，研究仿刺参对盐度变化的反应，对探讨不同盐度下仿刺参的生长及实际生产应用具有一定的指导意义。

前期研究表明，仿刺参在渗透压胁迫下，其热休克蛋白（Heat shock protein，Hsp）会随即被诱导产生［10］。热休克蛋白是一组具有重要生理功能、结构高度保守的蛋白质，在热胁迫、组织缺氧、渗透压胁迫、重金属污染等胁迫条件下都会大量产生。作为分子伴侣，Hsp参与细胞中变性蛋白的重折叠，防止变性蛋白被降解［11－14］。Hsp70是Hsp家族的重要成员在调节环境胁迫的影响以及维持细胞内动态平衡过程中发挥了重要作用［15－17］。Hsp90也是Hsp家族的重要成员，是蛋白质成熟过程中的分子伴侣，在维持蛋白质的稳定结构，参与细胞周期调节，机体免疫和信号传导等过程中发挥重要作用［18－19］。之前的研究表明，Hsp70家族在仿刺参应对渗透压胁迫以及热胁迫过程中能发挥重要作用［10，20－21］，但有关Hsp90对盐度胁迫响应的研究很少。因此本实验模拟自然环境中盐度变化模式，选择hsp70、hsp90a及hsp90b3条基因（其中hsp90a与hsp90b分别是2条序列不同的hsp90基因），进一步研究盐度骤变对hsp70及hsp90基因表达的影响，丰富仿刺参生理生态学理论，为保障仿刺参养殖提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验材料 实验所需仿刺参（Apostichopus japonicus）幼参采自山东省即墨市育苗场，平均体重为（0.43±0.11）g。由于夏季青岛养殖池塘的水温约为25℃，本实验选定25℃作为实验温度。购买的仿刺参转移至水槽后，以1℃·d－1逐渐升温至25℃。之后25℃暂养2周。

暂养期间不间断充气，光照周期为14 L∶10 D。水源为沙滤自然海水，每天换水1／2，海水盐度为30左右。换水前对海水进行预加热，防止换水造成水族箱温度变化过大。每天16：00按仿刺参体重的5%投喂青岛七好饲料有限公司生产的仿刺参配合饲料，组成为：粗蛋白（22.9±0.2）%、粗脂肪（2.1±0.0）%、灰分（34.7±0.6）%，含水量（9.0±0.0）%，能值（10.6±0.0）kJ·g－1。

1.1.2 酶和试剂 总RNA提取试剂盒购买自Invitrogen公司；cDNA第一链合成试剂盒购买自美国promega公司；半定量PCR Taq酶、Marker等购买自广州东盛科技有限公司，引物由华大基因合成。

1.2 实验方法

1.2.1 盐度变化 如图1所示，盐度变化共分4个阶段，第一阶段盐度由30降至20，每6 h降低2.5（J1、J2、J3分别表示盐度降至27.5、25、22.5后6 h）；第二阶段盐度在20水平上维持96 h（V1～V8分别表示盐度降至20后1、3、6、12、24、48、72及96 h）；第三阶段盐度由20升至30，每6 h升高2.5（S1、S2、S3分别表示盐度升至22.5、25、27.5后6 h）。第四阶段盐度30、维持96 h（N1～N8分别表示盐度升至30后1、3、6、12、24、48、72及96 h）。在图1所示，在各取样时点各随机取5头仿刺参，迅速解剖并取其体壁组织保存于－80℃超低温冰箱中。

图1 盐度变化模式图Fig.1 Diagram of the salinity change mode of experimental treatment

1.2.2 引物设计 本实验选取的3条基因hsp70，hsp90a和hsp90b，是从NCBI仿刺参cDNA文库中筛选的（Ajhsp70，GH985449；Aj90a，JF907619；Aj90b，GH550976）。引物设计使用软件Primer 5.0，实验中使用的引物见表1。将仿刺参的部分β－actin序列（312bp）作为内参，其引物序列来自Meng et al.［21］。

表1 仿刺参hsp基因表达所用的引物Table 1 Primer sets designed for semi－quantitative RT－PCR analysis of hsps mRNA in sea cucumber Apostichopus japonicus.

1.2.3 总RNA提取和cDNA第一链合成 仿刺参体壁组织总RNA的提取按照Trizol试剂盒说明书进行，cDNA第一链利用Oligo d T18作为引物合成。合成的第一链c DNA通过持家基因β－actin的半定量PCR检验其是否可用［21］。

1.2.4 hsp70，hsp90a及hsp90b半定量RT－PCR在半定量RT－PCR过程中使用等量的c DNA模板，PCR反应条件均已优化。PCR反应体系25μL，包括：2.5μL 10×PCR buffer，1.6μL MgCl2（25 mmol·L－1），2.0μL d NTPs（2.5 mmol·L－1），各1μL的上下游引物（10 pmol·m L－1），15.875μL灭菌水，0.125μL（5U·μL－1）Taq DNA聚合酶，以及1μL cDNA模板。RT－PCR反应程序如下：94℃5 min；接着是30个循环（hsp70、hsp90a及hsp90b）或28个循环（βactin）：94℃45 s，53℃（hsp70、hsp90a及hsp90b）或55℃（β－actin）45 s，72℃1 min；最后72℃延伸10 min。RT－PCR产物使用EB染色的1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，为了确保RT－PCR反应的特异性，产物进行胶回收并测序。电泳图使用Gene Tools软件分析，基因表达量通过其电泳图中光密度值与内参基因光密度值的比值表示（Chsp70／Cβ－actin，Chsp90a／Cβ－actinor Chsp90b／Cβ－actin）。

1.3 数据分析

数据统计采用SPSS13.0进行，各个基因不同取样点基因表达量的差异采用单因子方差分析（one－way ANOVA），以P＜0.05作为差异显著的标准。

2 结果

2.1 盐度变化对仿刺参hsp70基因表达的影响

图2为仿刺参hsp70基因的表达结果，可见在盐度由正常海水的30降至20过程中，hsp70基因的表达量逐渐升高，并在盐度降至20后1 h（V1）出现最大值（Chsp70／Cβ－actin＝0.758 4，约为对照组的2.4倍）。在20盐度下维持12 h后，hsp70基因表达量显著下降（P＜0.05，Chsp70／Cβ－actin＝0.455 2）。V8即表示96 h时表达量降至最低（Chsp70／Cβ－actin＝0.364 7）。从S1点起盐度逐渐升高，hsp70基因表达量也逐渐升高，在S3点、即盐度升至27.5后的6 h表达量达到最大值（Chsp70／Cβ－actin＝0.690 1，约为对照组的2.2倍）；S3和盐度恢复30后1 h的N1，其hsp70基因表达量均显著高于初始点C（P＜0.05）。N2点为盐度恢复30后3 h的hsp70基因表达量，可见出现了明显的下降并在之后继续下降至接近初始点C。

图2 盐度变化对仿刺参hsp70基因表达的影响Fig.2 Levels of hsp70 in sea cucumbers Apostichopus japonicus during the salinity change

2.2 仿刺参hsp90s基因表达结果

仿刺参hsp90a、hsp90b基因表达量的变化趋势与hsp70基因相似（见图3）。如图3 A所示，hsp90a基因表达量在J3、即盐度降至22.5的6 h后显著增加（P＜0.05，Chsp90a／Cβ－actin＝0.788 8），在降至20的1 h后出现最大值（Chsp90a／Cβ－actin＝1.182，约为对照组的3.3倍），之后表达量逐渐下降；V3点即维持20盐度6 h后的表达量开始显著下降（P＜0.05，Chsp90a／Cβ－actin＝0.836 6），20盐度96 h后表达量降至最低、并接近初始值（Chsp90a／Cβ－actin＝0.454 3）；S1点开始盐度逐渐升高，hsp90a基因表达量也随之逐渐升高，在S3点盐度升至27.5后6 h表达量显著增加（P＜0.05，Chsp90a／Cβ－actin＝0.819 1，约为对照组的2.3倍），维持恒定盐度6 h后表达量出现了明显的下降，并在96 h降至接近初始值。在J3、V1、V2、V3、V4（盐度22.5、盐度降至20后1、3、6和12 h）以及S 3、N 1、N 2（盐度27.5、盐度恢复30后1和3 h）点的表达量显著高于初始点C。

如图3 B所示，hsp90b基因的表达量在V1点、即盐度降至20的1 h后显著增加并达到最大值（Chsp90b／Cβ－actin＝1.33 5，约为对照组的2.5倍），之后表达量逐渐下降；V4点、即维持20盐度12 h后表达量开始显著下降（P＜0.05，Chsp90b／Cβ－actin＝0.779 1）。20盐度96 h后表达量降至最低并接近初始值（Chsp90b／Cβ－actin＝0.572 1）；从S1点开始盐度逐渐升高，hsp90b基因表达量也随之逐渐升高，在S3点盐度升至27.5后6 h表达量显著增加（P＜0.05，Chsp90b／Cβ－actin＝0.991 8，约为对照组的2.2倍），之后表达量逐渐下降，并在96 h降至接近初始值；hsp90b在V1、V2、V3（盐度降至20后的1、3和6）以及盐度27.5的S3点的表达量显著高于初始点C。

图3 盐度变化对仿刺参（A）hsp90a，（B）hsp90b基因表达的影响Fig.3 Levels of（A）hsp90a，（B）hsp90b in sea cucumbers Apostichopus japonicus during the salinity change

3 讨论

3.1 盐度骤变对仿刺参的消极影响

盐度作为水产养殖环境中重要的理化因子，与养殖动物的生长、发育、繁殖等行为密切相关。实践表明，盐度的骤降会引起海参大规模的死亡［10，22－23］。夏季雨水较多，降水增加导致养殖池塘的盐度大幅变化。2005年吕伟志等监测了丹东椅圈镇仿刺参养殖池塘的盐度，发现在暴雨影响下海参养殖池水的盐度在十几个小时内从30骤降到20以下，且低至16的盐度持续了一个多月，个别被淡水淹没的池塘甚至不足10［24］。这种快速且大幅的盐度变化超出了海参对盐度的正常适应范围，常常会造成仿刺参大量发病、死亡，给仿刺参养殖带来极大的威胁和经济损失［6］。

3.2 盐度胁迫对仿刺参hsp基因表达的影响

热休克蛋白常被认为是生物体对环境胁迫响应的标志物［14］。在本实验中，当盐度降至20 6 h后hsp70、hsp90a以及hsp90b基因的表达量均显著高于初始值（P＜0.05），说明盐度20已显著低于仿刺参适宜盐度，并引起生物机体内相应生理生化变化。盐度胁迫会对细胞内离子调控产生不利的影响，hsp基因随即诱导表达，指导热休克蛋白（Hsps）合成，参与细胞功能修复［8，14，25－26］。hsp基因转录与翻译以及参与细胞内生化反应是个耗能的过程。因此，长期处于这种胁迫条件下必然会导致海参的生长不良，从而影响幼参的生长。王吉桥等指出，盐度为26时幼参的生长速度比盐度33时减少了62.5%，而盐度22的处理组中幼参出现了负增长［27］。袁秀堂等人认为，当外界盐度与仿刺参体液等渗透点盐度31.5一致时，仿刺参的能量消耗最低，生物能转化效率较高［28］。

3.3 hsp基因表达的时序性

hsp基因的表达具有时序性，Dong等［29］以及Meng等［30］发现仿刺参热激72 h后Hsp70表达量降至初始值。在本实验中hsp70、hsp90a及hsp90b基因均出现了时序性表达，在盐度下降后基因表达量显著升高（P＜0.05），随后表达量又逐渐下降至初始水平，其中hsp70、hsp90b基因表达量在低盐条件下6 h仍可保持较高水平，但在12 h时表达量显著下降（P＜0.05）；hsp90a基因表达量在低盐条件下3 h仍保持较高水平，但在6 h时显著下降（P＜0.05）。在盐度由20升至30的过程中hsp70、hsp90a及hsp90b基因表达量再次显著升高（P＜0.05），随后表达量再次下降，其中hsp70、hsp90b基因表达量在盐度维持在30的3 h后仍保持较高水平，但在6 h时表达量出现明显下降。hsp90a基因表达量在盐度维持在30的6 h仍保持较高水平，但在12 h时开始出现明显下降。在第二次盐度骤变（即由20升至30）过程中，hsp70、hsp90a和hsp90b基因的表达量相对于第一次盐度骤变（即由30降至20）要低，并且表达量在高水平维持的时间较短，即表达量下降较快，推测可能是由于经历96h的低盐处理，仿刺参长时间处于不适宜的生存环境，影响了其体内生理生化反应，使其代谢率降低，在这种较低代谢的情况下无法提供足够的能量用于合成热休克蛋白。也有可能是盐度30在仿刺参适宜范围内，仿刺参体内蛋白变性减少，因此hsp基因上调表达低于降盐过程。

本实验的结果表明，盐度骤降可引起热休克蛋白表达的上调，在较长时间的低盐度胁迫过后，仿刺参无法产生足够的热休克蛋白用于细胞修复，降低了仿刺参对胁迫条件的耐受能力，从而进一步影响仿刺参的生存。因此在实际生产实践中，在持续下雨或暴雨过后应及时换水或对养殖池塘进行投盐，以尽快恢复适宜盐度。此外，目前的研究表明多种环境胁迫可诱导仿刺参hsp70基因的表达［10，20，29］，在本实验中hsp90a及hsp90b基因在盐度胁迫条件下表达量也表现出了与hsp70基因相似的趋势，可推断hsp90基因的上调表达是仿刺参对环境胁迫的生理适应机制之一。

［1］ Mercier A，Battaglene S C，Hamel J F.Daily burrowing cycle and feeding activity of juvenile sea cucumber Holothuria scabra in response to environmental factors［J］.Journal of Experimental Marine Biology and Ecology，1999，239：125－156.

［2］ Asha P S，Muthiah P.Effects of temperature，salinity and p H on larval growth，survival and development of the sea cucumber Holothuria spinifera Theel［J］.Aquaculture，2005，250：823－829.

［3］ Hamel J F，Conand C，Pawson D L，et al.The sea cucumber Holothuria scabra（Holothuroidea Echinodermata）：Its biology and exploitation as Beche－de－mer［J］.Advances in Marine Biology，2001，41：129－223.

［4］ Chen J X.Present status and prospects of sea cucumber industry in China［M］.∥Lovatelli A，Conand C，Purcell S，Eds.Japan：Advances in Sea Cucumber Aquaculture and Management，FAO，Rome，2004：25－38.

［5］ 宋希和，柳振东.刺参池塘养殖技术［J］.水产科技情报，2005，32（1）：27－29.

［6］ 周维武.暴雨对海参养殖环境的影响与应急对策［J］.科学养鱼，2006（3）：11.

［7］ 龚海滨，王耀兵，邓欢，等.仿刺参对盐度的耐受能力研究［J］.水产科学，2009，5：284－286.

［8］ Yancey P，Clark M，Hand S，et al.Living with water stress：evolution of osmolyte systems［J］.Science，1982，217：1214.

［9］ Diehl W J.Osmoregulation in echinoderms［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part A，1986，84：199－205.

［10］ Dong Y W，Dong S L，Meng X L.Effects of thermal and osmotic stress on growth，osmoregulation and Hsp70 in sea cucumber（Apostichopus japonicus Selenka）［J］.Aquaculture，2008，276：179－186.

［11］ Storz G，Polla B S.Stress－Inducible Cellular Responses［M］.Berlin：Basel Boston，1996：239－254.

［12］ Hartl F U.Molecular chaperones in protein folding［J］.Nature，1996，381：571－580.

［13］ Morimoto R I.Regulation of the heat shock transcriptional response：cross talk between a family of heat shock factors，molecular chaperones，and negative regulators［J］.Genes ＆Development，1998，12：3788－3796.

［14］ Feder M E，Hofmann G E.Heat shock proteins，molecular chaperones，and the stress response：evolutionary and ecological physiology［J］.Annual Review of Physiology，1999，61：243－282.

［15］ Geething M J，Sambrook J.Protein folding in the cell［J］.Nature，1992，355：33－45.

［16］ Parsell D A，Lindquist S.The function of heat－shock proteins in stress tolerance：degradation and reactivation of damaged proteins［J］.Annual Review of Genetics，1993，27：437－496.

［17］ Ellis R J.Stress proteins as molecular chaperones［M］.∥Van Eden W，Young D B，Eds.New York：Stress Proteins in Medicine，Marcel Dekker，Inc.，1996：1－27.

［18］ Wiech H，Buehner J，Zimmermann R，et al.HSP90 chaperones protein folding in vitro［J］.Nature，1992，358：169－170.

［19］ Holley S J，Yamamoto K R.A role for HSP90 in retinoid receptor signal transduction［J］.Molecular Biology of the Cell，1995，6：1833－1842.

［20］ Dong Y W，Dong S L，Ji T T.Effect of different thermal regimes on growth and physiological performance of the sea cucumber Apostichopus japonicus Selenka［J］.Aquaculture，2008，275：329－334.

［21］ Meng X L，Ji T T，Dong Y W，et al.Thermal resistance in sea cucumbers（Apostichopus japonicus）with differing thermal his－tory：The role of Hsp70［J］.Aquaculture，2009，294：314－318.

［22］ Kashenko S.Acclimation of the sea cucumber Apostichopus japonicus to decreased salinity at the blastula and gastrula stages：its effect on the desalination resistance of larvae at subsequent stages of development［J］.Russian Journal of Marine Biology，2000，26：422－426.

［23］ Li L，Li Q.Effects of stocking density，temperature，and salinity on larval survival and growth of the red race of the sea cucumber Apostichopus japonicus（Selenka）［J］.Aquaculture International，2010，18：447－460.

［24］ 吕伟志，戴晓军，李东站.刺参养殖技术之一：低盐度海水池塘刺参技术探讨［J］.水产养殖，2006，1：42－43.

［25］ Deane E，Kelly S，Luk J，et al.Chronic salinity adaptation modulates hepatic heat shock protein and insulin like growth factor I expression in black sea bream［J］.Marine Biotechnology，2002，4：193－205.

［26］ Morimo to R，Santoro M.Stress－inducible responses and heat shock proteins：New pharmacologic targets for cytoprote ction［J］.Nature Biotechnology，1998，16：833－838.

［27］ 王吉桥，张筱犀，姜玉声，等.盐度骤降对幼仿刺参生长、免疫指标及呼吸树组织结构的影响［J］.大连水产学院学报，2009，24（5）：387－392.

［28］ 袁秀堂，杨红生，周毅.盐度对刺参（Apostichopus japonicus）呼吸和排泄的影响［J］.海洋与湖沼，2006，37（4）：348－354.

［29］ Dong Y W，Dong S L.Induced thermotolerance and the expression of heat shock protein 70 in sea cucumber Apostichopus japonicus Selenka［J］.Fisheries Science，2008，74：573－578.

［30］ Meng X L，Dong Y N，Dong S L，et al.Mortality of the sea cucumber，Apostichous japonicus Selenka，exposed to acute salinity decrease and related physiological responses：Osmoregulation and heat shock protein expression［J］.Aquaculture，2011，316：88－92.

Effects of Salinity Fluctuation on the Expression of hsp 70 and hsp90s Genes in Sea Cucumber，Apostichopus japonicus Selenka

YU Shan－Shan1，WANG Qing－Lin1，MENG Xian－Liang1，DONG Yun－Wei2，DONG Shuang－Lin1
（1.The Key Laboratory of Mariculture，Ministry of Education，Fisheries College，Ocean University of China，Qingdao 266003，China；2.College of Oceanography，Xiamen University，Xiamen 361005，China）

The expression of hsp70，hsp90a and hsp90b genes in sea cucumber（apostichopus japonicus Selenka）were studied in a simulated field salinity decrease after a heavy rainfall in summer.Salinity firstly decreased gradually from 30 to 20 at a rate of 2.5 every 6 h，and then was maintained at 20.After 96 h at the low salinity（20），salinity was increased gradually to 30 at a rate of 2.5 every 6 h，and then was maintained at 30 for 96 h.Results showed that expressions of hsp70，hsp90a and hsp90b genes all increased after salinity decrease，led to the maximum levels at the lowest salinity，and then dropped to the original level after 72 h at low－salinity exposure.Similarly，the expression of these three genes in sea cucumber increased with the salinity increase，and decreased to the original level after 72 h at low－salinity exposure.Compared to the second salinity fluctuation，the gene expressions were lower than those of the first salinity fluctuation，which might be caused by energy budget.In this study the expression of hsp90a and hsp90b genes was similar to hsp70 gene’s expression，and the upregulated expression of hsp90s also could be regarded as the physiologic adaptation of Apostichopus japonicus to environmental stresses.

Apostichopus japonicus；salinity；heat shock protein

S917.4

A

1672－5174（2012）09－022－06

国家自然科学基金项目（30400333）；国家科技支撑计划项目（2006BAD09A01）；山东省优秀中青年科学家科研奖励基金计划项目（BS2009NY019）资助

2011－09－11；

2012－02－07

于姗姗（1987－），女，硕士生。E－mail：heiseyoumoys＠gmail.com

＊＊通讯作者：E－mail：dongyw＠xmu.edu.cn

责任编辑 朱宝象