陈道军,吴 明,詹 锋,林书典,符克英,韩 辉

(海南省人民医院，海口 570311)

IgA肾病(IgAN)是一种多病因引起的以肾小球系膜区IgA沉积为主的系膜增生性肾小球肾炎，已成为全球最常见的原发性肾小球疾病[1]。临床和病理表现多样化，个体预后差异悬殊，10%～20%的成年患者在10年内可进展为终末期肾脏病[2]。迄今为止尚无一种分型能准确地反映患者的临床实际情况，各个分型之间也很难达成一致。寻找肾脏病理组织中新的生物标志物以期预测IgAN病情的进展和预后，指导临床治疗将成为此研究的目的。作者选取在本院经肾活检明确诊断为IgAN患者的肾活检组织标本作为研究对象，应用间接免疫荧光技术，观察synaptopodin在IgAN患者肾组织中的表达，并探讨其在肾组织分布特征、进行相关分析，推测病情预后。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾分析2003年6月至2009年9月在本院经肾活检明确诊断为IgAN患者的202例肾活检组织标本，所有病例由一位高级职称病理医师独立阅片。所有标本已经过苦味酸液固定、石蜡包埋，2 μm厚度切片，均行苏木素伊红染色(HE)、过碘酸雪夫反应(PAS)、六胺银染色(PASM)和马松三色染色(Masson)，结合IgA等免疫荧光检测后已确诊为IgAN，所有染色标本均在冰箱中存放。复习病历，排除狼疮性肾炎、紫癜性肾炎及慢性肝病等继发性IgAN病例。所有病例在当初确诊时已按Lee分级系统[3-5]分为Ⅰ～Ⅴ级(分类)，按分层抽样的原则，用随机号码表抽取样本，从各级中分别随机选取10例标本。分5组，总共标本为50例。

1.2方法

1.2.1资料分析 对选取50例样本，从冰箱中调出已染色的病理标本，重新通过光镜观察，参照Katafuchi积分方法[6]，依据病变程度进行积分。

1.2.2间接免疫荧光染色 从冰箱中调取出已选定的石蜡包块，脱蜡、水洗、热修复抗原、加一抗(Mouse Anti-IgG Synaptopodin)4 ℃ 过夜。PBS(pH7.2～7.6)洗涤2 min×3次。滴加二抗(1∶40稀释)，FITC标记的兔抗小鼠IgG,37 ℃30 min。PBS(pH7.2～7.6)洗涤2 min×3次。

1.2.3每份肾脏病理组织同时行阴性对照。

1.2.4荧光显微镜观察结果。

1.2.5分析

1.2.5.1荧光图片拍照 用免疫荧光显微镜观察(×200)。把样品放到载物台上，快速选择视野，每视野有一个完整的肾小球，选择5个视野，立即拍照，在拍摄荧光照片时，确保每张照片的拍摄条件完全一致。

1.2.5.2图片分析 对所得的照片用Imagerpro6.0图像分析软件进行定量分析肾组织中synaptopodin的表达情况，测量每个肾小球截面总的积分光密度值(IOD SUM)及所测肾小球截面的面积(area SUM)，计算出平均光密度值[mean density=(IOD SUM)/(area sum)][7-8]。每例肾组织mean density由5个视野的相片经图像分析后取平均值。

1.3主要试剂及来源 synaptopodin 一抗(Mouse Anti-IgG Synaptopodin)购自美国Fitzgerald Industries International公司。二抗(1∶40稀释)，FITC标记的兔抗小鼠IgG 购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.4统计学处理 数据结果计量资料列表来显示，因所有的病例按Lee分级分为Ⅰ～Ⅴ级为多个独立样本的等级计量资料，所以，5组肾组织中Synaptopodin所表达的平均光密度值、Katafuchi积分进行组间比较将采取Kruskal-Wallis H 检验，通过观察平均秩次(mean rank)来判断组间数据变化。对synaptopodin所表达的平均光密度值与Katafuchi积分进行相关分析。采用SPSS16.0软件进行分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1肾组织中synaptopodin所表达的平均光密度值、Katafuchi积分进行组间比较 各组的平均光密度值见表1，经Kruskal-Wallis H 检验，从Ⅰ～Ⅴ级的平均秩次分别为44.30、35.30、26.15、16.25、5.50，H值为44.026，P<0.01；可认为5组的平均光密度值有差异，可看出随着病情的加重，synaptopodin的表达逐渐减少，见表2。

表1 各组间synaptopodin所表达的平均光密度值

5组样本通过光镜观察，参照Katafuchi积分方法，依据病变程度进行积分，经Kruskal-Wallis H 检验结果：从Ⅰ～Ⅴ级的平均秩次分别为7.00、16.60、23.80、34.60、45.50，H值为42.983，P<0.01；可认为5组的Katafuchi积分值有差异，可看出随着病情的加重，Katafuchi积分值遂渐增大，见表2。

表2 平均光密度及Katafuchi积分的各组平均秩次

2.2所有选取病例的肾脏组织中平均光密度值与Katafuchi 病理评分值间的相关性分析 通过统计学的Spearman相关分析，r=-0.992，P<0.01，故认为所有选取的病例，肾脏组织中synaptopodin蛋白所表达的平均光密度值与Katafuchi 病理评分值之间呈负的直线相关。

图1 所有病例的平均光密度与Katafuchi积分

3 讨 论

Barisoni等[9]报道了synaptopodin在局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)和HIV相关性肾病表达下调，而在正常儿童与MCD患者间无差别。Kemeny等[10]观察到在原发性FSGS早期阶段synaptopodin即消失。杨琪等[8]研究发现，synaptopodin表达从健康人、微小病变肾病(MCD)、IgAN、系膜增殖性肾炎(MsPGN)到局灶节段性FSGS依次下降，由此推断它的变化影响足细胞的结构和功能，对肾小球疾病的进展有重要作用。但是，对于synaptopodin的表达，目前，尚无关于IgAN病程的研究，synaptopodin能否作为反应IgAN病理程度的一项指标，本实验给予了解答。

本研究发现，synaptopodin沿肾小球毛细血管袢呈颗粒状、线状表达，在硬化区无表达；从表1经统计分析后可见从Ⅰ～Ⅴ级5组的IgAN患者，肾组织中synaptopodin所表达的平均光密度逐渐减少，也提示了IgAN患者肾组织中synaptopodin所表达的平均光密度值与Lee分级一样可以反应病情的严重程度，随着病情的加重，synaptopodin的表达逐渐减少。Katafuchi积分法[6]也可以反应出IgAN病情的变化，从表2经统计分析后可见，本实验结果也符合此变化，随着病情的加重，Katafuchi积分的分值也逐渐增加。从图1中可见，IgAN病程中肾组织内synaptopodin所表达的平均光密度与Katafuchi积分呈反向相关。

足细胞是维持肾小球滤过膜结构和功能正常的主要细胞之一。而足细胞特殊结构的维持主要依赖于以肌动蛋白为主的细胞骨架系统和足细胞中表达的特异性蛋白分子。足细胞减少是疾病活动性的重要标志[11]。Mundel和Stuart[12]总结了各种因素引起足细胞损伤的原因：(1)裂孔隔膜复合物及脂筏的异常；(2)GBM或足细胞-GBM相互作用的影响；(3)肌动蛋白细胞骨架及其与α-actinin-4的联系破坏；(4)足细胞丧失其表面的电荷屏障。而在actin细胞骨架相关蛋白中有一种由YNPO基因编码synaptopodin，该基因含3个外显子。synaptopodin是一种与肌动蛋白微丝紧密相连的富含脯氨酸的线状蛋白。足细胞的结构和功能之间有着密切的因果联系，足细胞具有对抗肾小囊内张力的结构基础。synaptopodin和α-actinin-4可以与足细胞表达的紧密连接蛋白MAGI-1相互作用而与肌动蛋白骨架连接[13]，其基因的突变或缺失可以导致足细胞结构的改变，引起蛋白尿和肾小球硬化的发生。足细胞的再生能力有限，当足细胞损伤时，足细胞只能通过有限的增生能力代偿缺失的足细胞。当损伤进一步加重时，足细胞从肾小球基底膜上剥脱的速度超出了足细胞的代偿能力，使肾小球基底膜部分区域裸露，肾小球滤过膜的完整性遭到破坏。足细胞损伤后数量减少将导致肾小球硬化[14]。

在IgAN肾小球固有细胞的研究方面，以往人们重点关注在系膜细胞的病变，目前，越来越多的肾脏病学者对肾小球足细胞在肾病中的变化及意义进行深入研究。Gagliardini和Benigni[15]发现IgAN的nephrin、podocin、podoplaninm表达减少。IgAN是一组临床综合征，临床表现为肾病综合征样改变，病理上也可表现有新月体肾炎或硬化性肾炎，临床表现多样性。Habib等[16]研究显示，IgAN时蛋白尿多少是影响预后的重要因素，无蛋白尿的患者预后良好。由于发病机制尚未完全阐明，目前，缺乏病因性治疗手段，IgAN治疗现状并不令人满意。很多研究都致力于寻找与预后或治疗相关的组织学危险因素。肾脏病理表现则能够提供更多的信息。除了较为公认的Haas和Lee分级系统，Katafuchi积分法[6]及其他多种半定量评分系统也得到了越来越多的应用。然而，迄今为止尚无一种分型能准确地反映患者的临床实际情况，各个分型之间也很难达成一致。传统的Lee分级或Katafuchi积分存在有较大的人为主观因素，不利于病情精确的评估及预测，特别是对于个体患者更不利于疗效的观察。

对于一些局灶节段性增生硬化型IgAN，其非硬化肾小球的病理形态呈轻微病理改变，传统的Lee分级或Katafuchi积分更不能反映病情的严重程度，诊断时可能均被列为Ⅰ级IgAN或Katafuchi积分较低，但局灶节段性增生硬化型IgAN预后并不乐观，甚至临床上可表现为大量蛋白尿。Yang等[17]对MCD患儿18例，DMH患儿7例，FSGS患者13例和正常儿童7例的肾组织进行免疫组化分析，并且用计算机图像分析法作定量研究，得出以下结论：从MCD到FSGS，snaptopodin的表达依次减少，尤其在MCD和FSGS之间synaptopodin的表达存在显著差异。可见，肾组织中synaptopodin的定量分析可对局灶节段性增生硬化型IgAN进行区分，synaptopodin所表达的平均光密度值的变化，可反应出IgAN病情。

通过荧光显微镜对肾组织中synaptopodin的观察并采用图像分析软件对其进行具体的量化评估。synaptopodin所表达的平均光密度值更能具体及客观地判断IgAN病情的变化及评估预后，同时可以观察疗效。也为IgAN的研究提供一种新的指标。

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