陆春雄，蒋泉福，唐 婕，谭 成，张建康

1.江苏省原子医学研究所 卫生部核医学重点实验室／江苏省分子核医学重点实验室，江苏 无锡 214063；2.江南大学 化学与材料工程学院，江苏 无锡 214122

目前，临床常用的肿瘤显像剂是氟（18F）标记的2-脱氧-2-氟葡萄糖（18F-FDG），是葡萄糖的类似物。然而，18F-FDG不是肿瘤的特异显像剂，因为还有很多其它细胞摄取葡萄糖比正常细胞高，如在炎症灶处发现的巨噬细胞［1］。另外，由于脑中的葡萄糖代谢很旺盛，所以18FFDG不适合脑部肿瘤的显像。因此，研究者们不断研发其它可供选择的肿瘤显像剂，如显示肿瘤增殖的放射性标记的胸苷衍生物：3’-脱氧-3’-氟胸苷［2］（18F-FLT，结构式如图1所示）。但是，18F需要加速器生产，而且18F标记的分子探针需要在特殊防护的热室中制备，这使得18F标记的分子探针价格比较昂贵，广大病人还难以承受。而锝（99Tcm）是SPECT显像中使用最普遍的放射性核素，由钼-锝发生器产生，价格低廉，而且有显像需要的理想核素特性（半衰期6h，能量140keV）［3］。因此，很多研究小组［4-7］对胸苷结构进行各种修饰，希望找到适合肿瘤显像的锝标记胸苷衍生物。

本工作拟对胸苷嘧啶环的5位和N-3位进行修饰，得到2个新的锝标记胸苷衍生物的前体｛2-巯基乙基-［2-（2-巯基乙基氨基）乙酰基］氨基｝-甲基-2’-脱氧尿苷（简称ANMdU）和N3-｛N’-［（2-巯基乙基氨基）乙酰基］-2-氨基乙基巯基-1-己酰胺基｝-胸苷（简称NHT）进行标记，得到99Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT（结构式如图1所示）。通过 考 察99Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT在 荷 瘤鼠体内的生物分布，评价它们作为肿瘤显像剂的可能性。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

β-胸苷，纯度大于99%，新乡拓新生化科技有限公司；对甲基苯甲酰氯和6-溴己酰氯，百灵威（J＆K）化学试剂有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。鼠源性肝癌HepA腹水、ICR小鼠，均由江苏省原子医学研究所提供。

MALDI SYNAPT Q-TOF MS质谱仪，美国Waters公司；AVANCEⅢ400MHz核磁仪，瑞士Bruker公司；C5002γ-计数器，美国PACKARD-COBRA公司；Yanadimoto熔点仪，日本株式会社，温度未校正。

1.2 实验方法

1.2.1 ANMdU的合成 ANMdU的合成及其鉴定等参见文献［7］的报道。

1.2.2 NHT的合成 合成路线图示于图2。

（1）3’，5’-二（对甲基苯甲酰酯基）-胸苷（化合物1）的合成

取8gβ-胸苷和1g 4-二甲氨基吡啶（DMAP）加入到500mL三颈烧瓶中，加入250mL二氯甲烷，在搅拌条件下，滴加10mL对甲基苯甲酰氯，滴毕，加热至回流，直至反应溶液变澄清，将反应液冷却至室温，用水洗涤，有机相干燥浓缩后，用二氯甲烷／乙酸乙酯（体积比为1∶1）重结晶，得13.8g白色晶体。产物产率为87.34%；熔点为202～204℃。

图1 18F-FLT、99 Tcm-ANMdU和99 Tcm-NHT的结构式Fig.1 Structure of 18F-FLT，99 Tcm-ANMdU and 99 Tcm-NHT

图2 NHT的合成路线Fig.2 Scheme for synthesis of NHT

（2）N-｛［2-（2-（S-（4-甲氧基苄基）巯基）乙基氨基）乙酰基］-S-（4-甲氧基苄基）-2-氨基乙基巯基｝-6-溴-1-己酰胺（化合物2）的合成

在通氮气条件下，取2g N-［2-（2-（S-（4-甲氧基苯基）巯基）乙基氨基）乙酰基］-S-（4-甲氧基苯基）-2-氨基乙基硫醇和0.6g DMAP溶于50mL CH2Cl2中，于0℃滴加1g 6-溴己酰氯，滴毕，反应液温度逐渐升至室温，继续搅拌反应4h，分别加水和饱和NaHCO3溶液洗涤，有机层用无水Na2SO4干燥，浓缩过硅胶柱，洗脱剂为CH2Cl2，得2g白色固体。熔点为79～81℃。

（3）N-｛N’-［2-（2-（S-（4-甲氧基苄基）巯基）乙基氨基）乙酰基］-S-（4-甲氧基苄基）-2-氨基乙基巯基-1-己酰胺基｝-3’，5’-二（对甲基苯甲酰酯基）-胸苷（化合物3）的合成

在通氮气条件下，取0.2g化合物1，0.17g化合物2和2g K2CO3加入到100mL烧瓶中，加入50mL DMF／丙酮（体积比为1∶1）的混合液，于50℃搅拌反应20h，将反应液冷至室温，过滤，将滤液蒸干后用100mL乙酸乙酯溶解，加水洗涤，有机层用无水Na2SO4干燥，浓缩过硅胶柱，洗脱剂为乙酸乙酯／石油醚（体积比为1∶1），得白色固体0.27g，产率为96.4%。

（4）N-｛N’-［2-（2-（S-（4-甲氧基苄基）巯基）乙基氨基）乙酰基］-S-（4-甲氧基苄基）-2-氨基乙基巯基-1-己酰胺基｝-胸苷（化合物4）的合成

取0.26g化合物3，加入30mL 0.27mol／L的甲醇钠甲醇溶液，室温搅拌反应1h，蒸干甲醇，加50mL水和50mL氯仿振荡，分出有机层，用无水Na2SO4干燥，浓缩过硅胶柱，洗脱剂为氯仿／甲醇（体积比为1∶1），得白色泡沫状固体0.16g，产率为86.0%。

（5）N-｛N’-［（2-巯基乙基氨基）乙酰基］-2-氨基乙基巯基-1-己酰胺基｝-胸苷（化合物5，NHT）的合成

在冰水浴条件下，将0.15g化合物4溶于5mL三氟乙酸中，加入0.17g醋酸汞和0.26mL苯甲醚，反应液呈棕色，将反应液逐渐升至室温，在室温继续搅拌30min，抽干溶剂，得深紫色油状物，真空干燥30min，加入15mL干燥乙醚，搅拌10min，倾去乙醚，真空干燥30min，用15mL乙醇溶解干燥物，通硫化氢气体20min后，4 000r／min离心5min取出上清液浓缩，得淡黄色油状物0.09g，即标记前体NHT，产率为68.7%。

1.2.399Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT的制备 取30μg标记前体（ANMdU或者NHT），溶于30μL乙醇中，加入80μL 10g／L葡庚糖酸钠溶液、80μL 10g／L乙二胺四乙酸溶液、15μL 5g／L氯化亚锡溶液，再加入1mL（74MBq）高锝酸钠淋洗液（Na99TcmO4），密闭，摇匀后于100℃加热30min，冷却后点样，以聚酰胺薄膜为载体，甲苯／乙腈／甲醇（体积比为3∶1∶1）为展开剂。

1.2.499Tcm-NHT的稳定性研究 将制备得到的99Tcm-NHT通 过0.22μm的 无菌滤膜制成99Tcm-NHT注射液，分别于0、1、2、3、4、5、6h测定放射化学纯度。

1.2.5 肝癌HepA荷瘤鼠的制备 抽取保种小鼠体内的肝癌HepA腹水，用生理盐水稀释4倍。取0.2mL腹水溶液（约2×106个肿瘤细胞）经皮下注射，接种于小鼠的右前肢腋下，正常饲养一周左右，肿瘤直径大约0.8cm，备下一步实验。

1.2.699Tcm-NHT正常小鼠体内分布 取ICR小鼠25只，分为5组，每组5只，经尾静脉注射0.2mL（3.7×106Bq）99Tcm-NHT，分别于注射后5、30、60、120、180min断头处死。解剖取出脑、肿瘤、心、肝、脾和肺等脏器，称重后测量放射性计数，计算每克组织百分注射剂量率。

1.2.799Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT在 肝 癌HepA荷瘤鼠体内分布 取荷瘤鼠25只，分为5组，每组5只，经尾静脉注射0.2mL（3.7×106Bq）99Tcm-ANMdU（或99Tcm-NHT），分别于注射后5、30、60、120、180min断头处死。解剖取出脑、肿瘤、心、肝、脾和肺等脏器，称重后测量放射性计数，计算每克组织百分注射剂量率。

2 结果和讨论

2.1 NHT的合成

以β-胸苷为起始原料，经多步反应合成得到标记前体NHT，反应的总收率为34.68%。

化合物1的MS（m／z）：479（M＋H），501（M＋Na）。1H NMR（CDCl3，δ）：8.22（s，1H），7.93（t，4H），7.29（t，4H），7.26（s，1H），6.43～6.48（q，1H），5.64（d，1H），4.64～4.81（dd，2H），4.52（q，1H），2.70（m，1H），2.43（d，6H），2.28～2.33（m，1H），1.62（s，3H）。

化合物2的MS（m／z）：611，613（M＋H），633，635（M＋Na）。1H NMR（CDCl3，δ）：8.25（s，1H），7.25（m，4H），6.85（m，4H），4.01（s，1H），3.89（s，1H），3.76（s，6H），3.70（s，2H），3.68（m，2H），3.40～3.48（m，4H），3.30（s，2H），2.50～2.61（m，4H），2.28～2.38（m，2H），1.82（m，2H），1.60（m，2H，），1.45（m，2H）。

化合物3的MS（m／z）：1 009（M＋H）。1H NMR（CDCl3，δ）：8.23（s，1H），7.93（q，4H），7.22～7.23（m，8H），7.20（s，1H），6.83（m，4H），6.49（m，1H），5.62（d，1H），4.64～4.78（dd，2H），4.51（d，1H），3.89（s，2H），3.86（s，2H），3.78（s，6H），3.66（d，4H），3.32～3.42（m，4H），2.69（dd，2H），2.49～2.60（m，4H），2.42（d，6H），2.22～2.32（m，2H），1.64（s，3H），1.56（m，4H），1.33～1.37（m，2H）。

化合物4的MS（m／z）：773（M＋1），795（M＋Na）。1H NMR（CDCl3，δ）：8.32（s，1H），7.33（s，1H），7.22（m，4H），6.83（m，4H），6.65（t，1H），6.16（m，1H），4.58（m，1H），3.98（dd，2H），3.93（m，2H），3.89（m，2H），3.78（s，6H），3.65～3.68（m，4H），3.32～3.42（m，4H），2.49～2.62（m，4H），2.42（m，2H），2.25～2.32（m，2H），2.22（m，1H），2.05（s，1H），1.91（s，3H），1.65（m，4H），1.35（m，2H）。

化合物5的MS（m／z）：533（M＋1），555（M＋Na）。1H NMR（CD3OD，δ）：8.25（s，1H），7.82（m，1H），6.31（t，1H），4.37～4.42（m，1H），4.16（s，1H），3.97（dd，2H），3.92（m，2H），3.73～3.80（m，2H），3.61（m，2H），3.5（m，1H），3.33～3.43（m，4H），3.22（m，1H），2.59～2.73（m，4H），2.42～2.53（m，2H），2.16～2.33（m，2H），1.91（s，3H），1.58～1.74（m，4H），1.35～1.42（m，2H）。

2.2 99Tc m-ANMdU和99Tc m-NHT的制备

99Tcm-ANMdU和99Tcm-NHT的 标记率均大于95%，锝胶体的Rf值 为0～0.1，99Tcm-ANMdU的Rf值为0.6～0.7，99Tcm-NHT的Rf值为0.5～0.6。

2.3 99Tc m-NHT的稳定性

结果表明，99Tcm-NHT 6h内稳定，放射化学纯度仍然大于93%。

2.4 99Tc m-ANMdU肝癌HepA荷瘤鼠体内分布

如表1所示，99Tcm-ANMdU在肾脏中的放射性摄取最高，膀胱次之，说明其主要是经肾脏代谢，且99Tcm-ANMdU在体内的清除很快，肝、肾、膀胱和血的5min时的放射性摄取与60min时放射性摄取的比值分别为4.22、3.13、4.21和12.06，这与99Tcm-ANMdU在 正常小鼠体内分布相一致［7］。99Tcm-ANMdU注 射60min后，荷瘤鼠体内肿瘤的放射性摄取与肌肉、骨和血的放射性摄取的比值达到较高值，分别为1.58±0.17、1.95±0.31和1.17±0.08。

表1 99 Tcm-ANMdU在荷瘤（HepA）小鼠体内分布Table 1 Biodistribution of 99 Tcm-ANMdU in tumor-bearing（HepA）mice

2.5 99 Tc m-NHT在正常小鼠和肝癌HepA荷瘤鼠体内分布

99Tcm-NHT在正常小鼠和肝癌HepA荷瘤鼠体内分布结果列入表2、表3。由表2、3可知：99Tcm-NHT在正常小鼠和荷瘤鼠体内肝脏和肾脏中的放射性摄取最高，说明其主要经肝脏和肾脏代谢；99Tcm-NHT在体内的清除相对较慢，在荷瘤鼠体内，肝、肾、膀胱和血的5min时的放射性摄取与60min时放射性摄取的比值分别为1.55、1.28、1.83和2.02，低 于99Tcm-ANMdU在体内的清除速度（4.22、3.13、4.21和12.06），但与18F-FLT在小鼠体内的清除速度接近［8］。值得注意的是，99Tcm-NHT在 脾 脏 中 的放射性摄取较高，且在60min时达到最大，这是因为脾脏中细胞增殖比较旺盛，与18F-FLT在脾脏中的放射性摄取增加相一致［8］。99Tcm-NHT注射120min后，荷瘤鼠体内肿瘤的放射性摄取与肌肉、骨和血的放射性摄取的比值达到较高值，分别为4.41±0.32、2.45±0.24和1.51±0.18，高于18F-FLT注射60min后肿瘤与肌肉、骨和血的放射性摄取比值［9］1.53、0.47、1.48。

2.6 讨论

人们在不断探索99Tcm标记胸苷衍生物作为肿瘤显像剂的潜力，较早的是2004年Zhang等［6］对2’-脱氧-2’-氟代尿苷的5位进行修饰，通过戊烯基与N2S2配基连接，与99Tcm的标记率为42%，放射化学纯度为98%。2007年有多篇文献报道有关99Tcm标记胸苷衍生物的研究，如Teng等［4］对胸苷的3’位进行修饰，通过肼基烟酰胺（HYNIC）和其他配基一起进行99Tcm标记，放射化学纯度大于97%。这两篇文献都只报道合成和标记方面，而没有生物学的评价和显像。Celen等［3］对胸苷的N-3位进行修饰，通过丙基连接N2S2配基，认为由于99Tcm标记的基团太大，导致99Tcm标记胸苷衍生物对胸苷激酶（TK）的亲和性降低，显像结果不佳；然而，Desbouis等［5］研究发现，5’位进行修饰通过长链连接99Tcm的胸苷衍生物与TK有很好的亲和性。这说明可能胸苷母体结构与99Tcm标记基团之间的距离比99Tcm标记基团尺寸大小，对胸苷衍生物和TK亲和性的影响更大。

表2 99 Tcm-NHT在正常小鼠体内分布Table 2 Biodistribution of 99 Tcm-NHT in normal mice

表3 99 Tcm-NHT在荷瘤（HepA）小鼠体内分布Table 3 Biodistribution of 99 Tcm-NHT in tumor-bearing（HepA）mice

本工作的ANMdU是胸苷母体结构在5位通过1个亚甲基与N2S2配基相连，胸苷母体结构与99Tcm标记基团之间的距离很近；NHT是胸苷母体结构在N-3位通过1个六碳链与N2S2配基相连，胸苷母体结构与99Tcm标记基团之间的距离比ANMdU的大，而且99Tcm-NHT在肿瘤的放射性摄取与肌肉、骨和血的放射性的比值高于99Tcm-ANMdU相应的比值。这说明随着胸苷母体结构与99Tcm标记基团之间距离的增大，可能可以增加胸苷衍生物对TK的亲和性。

3 结 论

99Tcm-ANMdU在荷瘤鼠体内主要经肾脏代谢，且在体内清除迅速，但在肿瘤和血的放射性比值不高；99Tcm-NHT在小鼠体内清除比99Tcm-ANMdU缓慢，但120min时肿瘤中的放射性摄取较高，肿瘤和肌肉、骨及血的放射性比值分别为4.41±0.32、2.45±0.24和1.51±0.18，99Tcm-NHT可能是潜在的SPECT肿瘤显像剂，值得进一步研究。

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