郑淋,游丽君,赵谋明

(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州,510640)

不同杀菌工艺对泥鳅多肽抗氧化活性的影响＊

郑淋,游丽君,赵谋明

(华南理工大学轻工与食品学院,广东广州,510640)

研究了巴氏杀菌、煮沸灭菌和高压蒸汽灭菌 3种杀菌工艺对泥鳅多肽抗氧化活性的影响。结果表明,泥鳅多肽经 100℃/20 min煮沸灭菌和 121℃/15 min高压蒸汽灭菌后,在 420 nm处吸光值显著增大,且在此条件下能保持较高的氧自由基吸收能力 (ORAC值);3种杀菌工艺均使泥鳅多肽清除 DPPH自由基能力及还原力有所下降,其中高压蒸汽灭菌对其影响最小;而巴氏杀菌及高压蒸汽灭菌却使泥鳅多肽螯合 Cu2+的能力有所提高。综合这 4个指标可以得出:泥鳅多肽具有良好的耐热性,经高压蒸汽灭菌后能保持较强的抗氧化活性,这可能与其发生了美拉德反应有关。

泥鳅多肽,抗氧化活性,热杀菌,美拉德反应

对于抗氧化肽来说,目前的研究主要集中于肽类物质自身的抗氧化能力,关于有效成分在加工过程中的稳定性却很少有报道。杀菌处理是肽类物质在加工过程中的关键环节,恰当的杀菌工艺不仅能杀灭微生物、钝化酶的活性,还能生成一些特殊的活性物质。例如高温下还原性糖类与氨基化合物 (氨基酸、蛋白质、肽类)发生美拉德反应的产物 (MRPs)中的类黑精、还原酮及一些含氮、硫的杂环化合物具有较强的抗氧化活性,某些物质的抗氧化能力甚至与常用的食品抗氧化剂相当[1-3]。Sonia等人研究发现对牛奶进行 80℃、100℃及 120℃的热处理后,抗氧化活性有所提高,且 120℃热处理使其抗氧化活性增加的幅度最大,他们认为这不仅仅是由于抗氧化物质发生降解,还可能是因为美拉德反应初级阶段生成的一些产物导致的[4]。而 Taylor等人则认为,牛奶经热处理后抗氧化活性有所提高,是由于在高温下牛奶中的蛋白质展开,暴露出巯基,提供了供氢体[5]。因此目前许多学者主张制备MRPs加入食品体系中或者应用热处理工艺使体系生成具有更强抗氧化活性的MRPs,从而提高产品抗氧化稳定性[6]。但不恰当的杀菌处理则会对肽类物质的品质产生一定的负面影响,例如加热带来的美拉德反应和蛋白质降解可能会导致一些营养成分的损失和破坏以及活性的下降[7]。

本课题组之前研究发现,经过木瓜蛋白酶水解得到的泥鳅多肽具有很强的抗氧化活性,并研究了加工和贮藏条件对泥鳅多肽抗氧化活性的影响[8-9],但还未系统地分析不同杀菌工艺对泥鳅多肽抗氧化活性的影响。本文采用了 DPPH自由基清除能力、ORAC值、还原力及螯合 Cu2+能力 4个评价指标,考察了不同热杀菌工艺对泥鳅多肽抗氧化活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

鲜活泥鳅,购于市场,蛋白质含量为 17%;木瓜蛋白酶,活力为 6×105U/g,江门拜奥生物科技有限公司;Trolox,FL及 AAPH,Sigma-Aldrich公司;其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

PHS-3C精密 pH计,上海雷磁仪器厂;高压灭菌锅,山东新华医疗器械厂;MM12型绞肉机,广东省韶关市食品机械厂;UV-754分光光度计,上海精密科学仪器有限公司;KDN-2C型定氮仪,上海纤检仪器有限公司;GL-21M高速冷冻离心机,长沙湘仪离心机仪器有限公司;微型漩涡混合仪,沪西分析仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 泥鳅多肽的制备

鲜活泥鳅→绞成肉糜→冷冻备用→解冻→加水搅打均匀 [液料比为 2∶1(w/w)]→酶解 [加酶量为0.3%(w/w)、温度 55 ±1 ℃、时间 4.5 h]→灭酶 (沸水浴,10 min)→冷却→离心 (8 000 r/min、15 min)→收集上清液→泥鳅多肽

1.3.2 泥鳅多肽的热杀菌处理

将制备得到的泥鳅多肽进行 3种不同的热杀菌处理:63℃、30 min巴氏灭菌;100℃、20 min煮沸灭菌;121℃、0.1 MPa、20 min高压蒸汽灭菌。

1.3.3 美拉德反应褐变程度的测定

美拉德反应往往伴随着褐变现象,产生的一类物质称为类黑精,随着美拉德反应程度的增加,产物颜色也越来越深,通过在 420 nm测定不同热处理的泥鳅多肽吸光值来反映美拉德反应的褐变程度,以探讨泥鳅多肽发生美拉德反应与抗氧化活性之间的关系。

1.3.4 氧自由基吸收能力 ( ORAC)的测定

参照 B lanca等并加以改进[10-11]。FL(荧光素钠盐)、AAPH(自由基产生剂)、标准抗氧化物质 Trolox(VE水溶性类似物)以及待测样品均用 7 5 mmol/L磷酸盐缓冲液溶解和稀释。具体操作为:在 96孔板各微孔中分别加入待测样品 2 0μL后添加缓冲溶液 20 μL及 FL(70 nmol/L)20μL,在 37℃下预置 15 min后,用多道移液器迅速在各孔中加入 AAPH(12.8 mmol/L)140μL启动反应,并将微孔板置于荧光分析仪中在 3 7℃下以激发波长 485 nm,发射波长 528 nm进行连续测定,每 2 min测定 1 次各孔荧光强度,测定 1 08 min,荧光强度分别记为 f0,f1,f2…f54。将记录的各微孔不同时间点的绝对荧光强度数据 fi与初始荧光强度相比,折算成相对荧光强度,并根据公式AUC=1+,统计荧光熄灭曲线下面积(AUCsample)值,然后根据公式 n e tAUC=AUCsample-AUCblank,分别计算不同浓度 Trolox和泥鳅多肽的 net AUC值,其中 A UCblank为没有抗氧化剂存在时自由基作用对照的 A UC值。netAUC值与 Trolox的不同浓度建立的直线回归方程为:y=4.865 8x-8.000 7(R2=0.999 1)。根据回归方程及经过不同热杀菌处理后泥鳅多肽的 netAUC值,计算得出泥鳅多肽的ORAC值,ORAC值以μmol Trolox当量 ( TE)/g表达。

1.3.5 DPPH自由基清除率的测定

加入不同浓度的待测样品 100μL和 0.2 mmol DPPH乙醇溶液 100μL于 96孔板中,振荡 30 s,在37℃下保温 3 0 min后,在 5 17 nm波长下测定其吸光值(As);同时测定不加 DPPH的样品空白吸光值(Ao)和加 D PPH但不加样品 ( 以 1 00μL乙醇代替样品)的吸光值 A c。

1.3.6 还原力的测定方法

还原力的测定参照 A li等人的方法进行[12]。

1.3.7 螯合 C u2+能力的评价方法

参照 A nn等人的方法进行[13]。

1.4 数据统计与分析

每个实验重复 3次,结果表示为 M eans±SD,采用 SPSS 13.0软件进行 One-way ANOVA分析。LSD检验用来确定数据间的差异,显著水平为 P<0.05。

2 结果与分析

2.1 美拉德反应褐变程度的测定

泥鳅多肽经不同热杀菌方式处理后在 420 nm下的吸光值如图 1所示。从图 1看出,泥鳅多肽经 100℃/20 min煮沸灭菌和 121℃/15 min高压蒸汽灭菌后,吸光值与对照样品相比均有显著性提高 (P<0.05),说明泥鳅多肽发生了美拉德反应;而经 63℃/30 min巴氏灭菌后,吸光值显著下降 (P<0.05),颜色较透明;此外,泥鳅多肽经 121℃/15 min高压蒸汽灭菌后,含有少量的絮状沉淀,这可能是因为蛋白质与肽类物质在高温下发生美拉德反应或者蛋白质及多肽部分变性生成不溶的物质。

图 1 不同杀菌工艺对泥鳅多肽在420 nm下吸光值的影响

2.2 不同杀菌工艺对泥鳅多肽抗氧化能力指数(ORAC)的影响

经过不同杀菌工艺处理后泥鳅多肽的 ORAC值如图 2所示。从图 2可以看出,与对照组相比,63℃/30 min巴氏杀菌使泥鳅多肽的 ORAC值显著下降 (P<0.05);而 100℃/20 min煮沸灭菌使泥鳅多肽的ORAC值有显著性提高 (P<0.05);121℃/15 min高压蒸汽灭菌对泥鳅多肽的 ORAC值无显著性影响 (P>0.05)。由此可知泥鳅多肽经过 100℃/20 min煮沸灭菌及 121℃/15 min高压蒸汽灭菌均能保持较高的 ORAC值,且在 121℃/15 min高压蒸汽灭菌后最稳定。

2.3 不同杀菌工艺对泥鳅多肽清除 DPPH自由基活性的影响

泥鳅多肽经不同热杀菌方式处理后对 DPPH自由基的清除结果如图 3所示。从图 3可以看出,与未杀菌的泥鳅多肽相比,经 3种杀菌方式处理后泥鳅多肽清除 DPPH自由基的 I C50值均有所升高,说明清除DPPH自由基能力均有所下降,以 63℃/30 min巴氏杀菌和 100℃/20 min煮沸灭菌变化最多,对照组的IC50值为 1.11 mg/mL,而这两组的 I C50值分别增加至1.65 mg/mL和 1.66 mg/mL,这可能是热处理破坏了泥鳅多肽的结构,发生了变性,导致活性下降;而 121℃/15 min高压蒸汽灭菌对泥鳅多肽清除 DPPH自由基影响较小,可能是泥鳅多肽自身虽发生变性,活性下降,但在 121℃高温条件下发生美拉德反应生成了具有一定抗氧化活性的物质,因而活性相对于另外两种杀菌方式有所提高。Sumaya-Martinez等人研究也发现美拉德反应产物对 DPPH自由基的清除能力随着反应温度的升高而增强[14]。

图 2 不同杀菌工艺对泥鳅多肽 ORAC的影响

图 3 不同杀菌工艺对泥鳅多肽清除DPPH自由基的影响

2.4 不同杀菌工艺对泥鳅多肽还原力的影响

不同杀菌工艺对泥鳅多肽还原力的影响结果如图 4所示,从图 4可以看出,泥鳅多肽在 2～10 mg/mL,其浓度与其还原力之间有良好的线性关系,其回归方程及相关系数如表 1所示。结合表 1及图 4可以发现,泥鳅多肽经热杀菌处理后,还原力均有所下降,且与 DPPH自由基清除率的测定结果一致,63℃/30 min巴氏杀菌和 100℃/20 min煮沸灭菌对其影响较大,而 121℃/15 min高压蒸汽灭菌对其影响较小。这可能由于还原力大的样品,是良好的电子及氢供应者,可以与自由基反应,使自由基成为较稳定的物质,从而中断自由基的连锁反应,这就为清除自由基发挥抗氧化作用提供了可能。

表1 泥鳅多肽浓度与还原力之间的线性关系

图 4 不同杀菌工艺对泥鳅多肽还原力的影响

图 5 不同杀菌工艺对泥鳅多肽螯合 Cu2+能力的影响

2.5 不同杀菌工艺对泥鳅多肽螯合 Cu2+能力的影响

不同杀菌工艺对泥鳅多肽螯合 Cu2+能力的影响如图 5所示。从图 5可以看出,泥鳅多肽对 Cu2+具有一定的螯合能力,在 1.0～5.0 mg/mL,随着泥鳅多肽浓度的增大,经过热杀菌处理后的泥鳅多肽螯合Cu2+能力均呈先迅速增加后趋于平缓的趋势;与对照组相比,泥鳅多肽经过 63℃/30 min巴氏杀菌和121℃/15 min高压蒸汽灭菌后,螯合 Cu2+能力有所增加;而经 100℃/20 min煮沸灭菌后,螯合 Cu2+能力略有下降。这与清除 DPPH自由基及还原力的测定结果不一致,主要是由于多肽的抗氧化机制不一样。抗氧化肽能够螯合 Cu2+主要是因为肽链上的某些残基上含有能螯合金属离子的基团,而发挥清除自由基功效以及具有还原能力是由于肽链上具有供氢体或未配对的电子。但从这个指标也可以看出,高压蒸汽灭菌有利于泥鳅多肽螯合 Cu2+。

3 结论

泥鳅多肽经 100℃/20 min煮沸灭菌和 121℃/15 min高压蒸汽灭菌后,在 420 nm处吸光值显著增大,说明发生美拉德褐变程度较大,且这两种杀菌方式能使泥鳅多肽保持较高的 ORAC值,其中 100℃/20 min煮沸灭菌甚至较对照组有显著性的提高 (P<0.05);3种杀菌方式均使泥鳅多肽的 DPPH自由基清除能力及还原力有所下降,以 121℃/15 min高压蒸汽灭菌对其影响最小;而 63℃/30 min巴氏杀菌和121℃/15 min高压蒸汽灭菌却使泥鳅多肽螯合 Cu2+能力有所提高,100℃/20 min煮沸灭菌使其下降。综合这 4个抗氧化指标可以得出:121℃/15 min高压蒸汽灭菌对泥鳅多肽活性的影响最小,可能与其自身发生的美拉德反应有关,因此在今后的加工中可选用这种杀菌方式。

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Effect of Sterilization on the Antioxidant Activity of Loach Peptide

Zheng Lin,You Li-jun,Zhao Mou-ming
(College ofLight Industry and Food Sciences,South China University of Technology,Guangzhou 510640,China)

The effect of pasteurization,boiling sterilization and high-pressure steam sterilization on the antioxidant activity of loach peptide were investigated.The results showed that the absorbance of loach peptide at 420 nm increased significantly,which was treated by boiling sterilization or high-pressure steam sterilization.Under this condition,the loach peptide couldmaintain a highORAC value.Both theDPPH free radical scavenging activity and the reducing power of loach peptide decreased after thermal sterilization treatment,while high-pressure steam sterilization had the least influence on it.Pasteurization and high-pressure steam sterilization could enhance the Cu(Ⅱ)ion chelating activity of loach peptide.Based on the above results,we can conclude that loach peptide had good heat resistance and it could maintain stronger antioxidant activity by high-pressure steam sterilization,which may be related to theMaillard reaction.

loach peptide,antioxidant activity,thermal sterilization,Maillard reaction

硕士研究生 (游丽君教授为通讯作者)。

＊国家“十一五”科技支撑计划项目(2006BAD27B03,2006BAD27B04)

2010-10-08,改回日期:2010-12-01