石 瑞， 曹诣斌， 陈文荣， 郭卫东

(浙江师范大学化学与生命科学学院，浙江金华 321004)

GRAS蛋白家族是高等植物所特有的具有高度保守羧基末端的蛋白质转录因子家族，长度在400～700个氨基酸，1999年首次被命名，GRAS取于最早被发现的3个功能成员GAI，RGA与SCR［1］．目前，在烟草、大豆、蓖麻、拟南芥、杨树等植物中都有发现．从拟南芥基因组中鉴定了33个GRAS家族基因，被分为7个分支，分别是DELLA蛋白分支、SCR分支、Ls分支、HAM分支、PAT1分支、SHR分支和SCL9分支［2］．它们在植物信号转导、激素调节及分生组织的保持中起关键性作用［3］．GRAS 家族具有转录因子活性［1］，参与了植物信号转导和发育过程．已报道的GRAS家族基因包括控制植物根部径向细胞分裂的SHR和SCR1、参与赤霉素激素信号途径的GAI1和RGA1和参与光信号途径的 PAT1和 SCL13［3-7］．Achard等［8］证明，拟南芥依赖CBF1的冷诱导信号途径能够通过影响赤霉素(GA)的代谢来调节抑制蛋白DELLA的积累，而DELLA蛋白通过有别于CBF诱导的低温调节机制大大地促进了CBF1诱导的冷驯化和抗冻性作用．DELLA蛋白在整合体内信号和逆境信号进而调节植物生长发育方面起着关键的作用［9］．

佛手(Citrus medica var．sarcodactylis Swingle)是浙江、广东、广西、四川、福建等地重要的特色经济树种，在浙江以金华的“金佛手”最为著名，树体矮小并适合作观赏盆景［10］．但是，佛手抗寒性差，低温对佛手的影响非常严重．因此，对佛手抗逆机理的研究及其抗逆新品种的培育显得越来越紧迫．郭卫东等［11］从佛手半致死温度入手对其抗寒性生理生化指标进行了研究．佛手常规杂交育种的难度很大，因此需要挖掘其自身抗低温逆境的基因，研究其分子作用机理，并通过操作这类基因的表达来实现佛手对不良环境的适应．

笔者用抑制消减杂交方法从佛手中筛选得到了与低温相关的一段表达序列标签(EST)片段，结合RACE技术克隆得到该基因的全长序列，对该基因进行了生物信息学分析，显示该基因具有GRAS保守结构域，并对该基因在不同时间低温胁迫下的表达特性进行了研究．

1 材料与方法

1．1 材料

选用的材料为长势一致的两年生浙江金华佛手品种“青皮”(C．medica cv．'Qingpi')的盆栽苗［10］．

1．2 处理

在人工气候室进行预培养，温度设置参照刘祖祺等［12］的方法，预培养温度为夜间20℃/白天28 ℃，光照每天14 h，光照强度为1 234．6 lx，湿度为75%，定期浇水．预培养3周后在2 d内将温度缓慢降至4℃进行冷锻炼7 d．在4℃下设置不同处理时间为0，12，24，36，48 h，0 h 为对照，取样进行分析，单株重复3次．

1．3 RNA的提取与第一链cDNA的合成

对来自佛手的10株植株的对照组与处理组(4℃培养12，24，36，48 h)的存储叶片采用 Trizol方法进行RNA提取，RNA第一链cDNA的合成使用M-MLV反转录酶cDNA试剂盒(TAKARA)，其合成的cDNA作为GRAS基因克隆与实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR，qRT-qPCR)的模板．

1．4 RACE方法对佛手GRAS基因的克隆

根据已获得的佛手EST片段，与美国国立生物技术信息中心(NCBI)数据库中与佛手EST同源性高的杨树、蓖麻、拟南芥的GRAS基因序列进行比对拼接，使用ClustalW2进行多序列比对，并通过 Oligo6，Primer Premier等设计引物 5(见表1)．以佛手叶片组织的单链cDNA为模板进行巢式PCR扩增．反应程序为:94℃预变性;94℃，30 s;50℃，30 s;72 ℃，30 s．电泳检测目的基因的存在．通过末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)对单链cDNA进行5'加尾反应，加尾后引入锚定引物QT进行锚定PCR．为了防止非特异性条带的产生，实验采用多组巢式引物(nested primer，见表1)进行多轮巢式扩增，获得GRAS基因的全长编码区序列．将PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳割胶回收后连接到PMD18-T载体(TAKARA)，送往生工生物工程(上海)有限公司进行序列测定．

1．5 同源性的生物信息学分析

应用NCBI数据库中循环延迟分集(CDD)分析目的基因的保守结构域;应用ClustalW2，MEGA 4．1对目的基因与已知序列基因进行多序列比对及进化树分析．

1．6 佛手GRAS基因在低温胁迫下的表达

利用荧光定量PCR方法分析佛手GRAS基因在不同时间低温胁迫下的表达．

4℃低温条件下分别对佛手植株进行0，12，24，36，48 h处理，以0 h为对照，提取佛手叶片的RNA反转录cDNA第一链为模板，佛手看家基因β-actin为内参进行荧光定量PCR分析．目的基因的引物为:GRAS 5':5'-ATGTCGCTCCACCCTCT-3';GRAS 3':5'-TACTGCCGCATTCCTCC-3'．内参β-actin的引物为:β-actin 5':5'-TCATACGGTCGGCAATA-3'，β-actin 3':5'-AAAGCCAAGGCGGTGAA-3'．

表1 GRAS基因5'和3'RACE巢式PCR扩增特异引物

使用ABI STEPONE荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR分析，采用20 μL反应体系:SYBRTM Premix Ex Taq 10 μL，正反向引物(10 μmol/L)各0．4 μL，ROX Reference Dye 50x 0．4 μL，cDNA 模板1 μL，ddH2O 7．8 μL．反应程序为:94 ℃ 预变性30 s;PCR反应:94℃ 5 s，50℃ 35 s，总共40个循环，每个样品进行3次重复检测．以β-actin作为内参，将一个cDNA样品经系列稀释后作为标准品来构建相对定量标准曲线，采用双标准曲线法求得待测样品的相对表达量．

2 结果与分析

2．1 RNA的提取与第一链cDNA的合成

取实验组和对照组的总RNA溶液5 μL，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳，检测RNA的质量，结果见图1．可以看到:实验组和对照组的总RNA有3条带，分别是28 S rRNA，18 S rRNA和5 S rRNA带，并且28 S rRNA带的亮度是18 S rRNA带的2倍．实验结果说明所提总RNA的完整性良好，没有降解现象．利用看家基因actin作为内参对合成的cDNA进行PCR检测．根据设计的actin引物，在53℃的退火温度下可得到400 bp左右的PCR产物(见图1)，说明cDNA制备成功．

图1 琼脂糖凝胶电泳图

2．2 序列分析

测序结果显示:该cDNA包含1 669个碱基;序列比对和同源性分析表明该cDNA包含1 236 bp的开放阅读框，编码413个氨基酸(见图2)．利用GenBank数据库提供的保守结构域数据库对佛手EST基因推导的氨基酸序列进行比对分析，表明该基因属于GRAS家族基因(见图3)，具有保守的GRAS结构域，因此命名为CmsGRAS(GenBank登录号:JF440647)．

2．3 序列同源比对

Blastx分析该基因的氨基酸序列与拟南芥已发现的33个GRAS基因的氨基酸序列进行同源性比对，采用MEGA 4．1软件，以邻近法(NJ)对佛手与拟南芥AtGRAS 1～33氨基酸序列绘制进化树，根据进化树的比对结果，显示佛手GRAS基因与拟南芥AtSCL5，PAT1基因的氨基酸序列同源性较高，亲缘关系较近(见图4)．

图2 佛手GRAS转录因子序列

图3 佛手GRAS保守结构域分析

2．4 GRAS基因低温处理的定量PCR分析

定量PCR分析表明(见图5):在4℃低温处理后，GRAS基因的表达量随处理时间的延长而逐渐升高，0 h时表达量最低，12 h时与对照差异不大，24 h时表达量较对照上升约7倍，36 h时表达量超过对照近10倍，达到最高．实验结果表明该基因的表达受到低温胁迫诱导，在36 h处理时间内随着低温胁迫时间的增加，其表达量呈上升的趋势，其表达量的增加可能与低温胁迫应答有关．

图4 佛手和拟南芥的GRAS序列进化树

图5 佛手在4℃寒冷胁迫下GRAS基因的荧光定量分析

3 讨论

通过RACE方法从佛手中获得一个GRAS基因，该基因具有GRAS蛋白家族的保守结构域，与拟南芥中发现的33个已知GRAS基因序列比对后，发现佛手的 GRAS氨基酸序列与拟南芥SCL5，PAT1基因同源性较高，因此推断获得的cDNA序列是佛手的GRAS基因．

采用低温胁迫处理研究佛手GRAS基因在寒冷胁迫下的表达特性，结果发现佛手植株在4℃处理后，在较短时间内诱导了该基因的表达，并随着胁迫时间的加长其表达量有逐渐上升的趋势，说明该基因对低温胁迫能够做出积极的反应．

Bolle等［5］研究表明，PAT1 与 SCL1/5/13 为同源亚族，PAT1在拟南芥中可能参与光敏色素A信号转导途径．文献［13］将 SCL1/5/8/13/21和PAT1列为一个分支，称为PAT1亚家族．郭华军等［14］实验证实 SCL5与 PAT1为一个分支，且SCL5能受到干旱和渗透胁迫诱导，并且其表达量在诱导处理时呈逐渐上升的趋势，证实它与干旱渗透胁迫有关．而佛手在4℃处理36 h时GRAS的表达量增加近10倍，明显高于对照，根据该基因对低温处理后转录水平的反应，推测它在佛手耐低温上有一定的作用，可能参与佛手逆境适应的调节．此结果为利用转基因手段选育耐低温的佛手新品种提供了理论依据．

［1］Pysh L D，Wysocka-Diller J W，Camilleri C，et al．The GRAS gene family in Arabidopsis:sequence characterization and basic expression analysis of the SCARECROW-LIKE genes［J］．Plant J，1999，18(1):111-119．

［2］Bolle C．The role of GRAS proteins in plant signal transduction and development［J］．Planta，2004，218(5):683-692．

［3］Di Laurenzio L，Wysocka-Diller J，Malamy J E，et al．The SCARECROW gene regulates an asymmetric cell division that is essential for generating the radial organization of the Arabidopsis root［J］．Cell，1996，86(3):423-433．

［4］Silverstone A L，Ciampaglio C N，Sun Taiping ．The Arabidopsis RGA gene encodes a transcriptional regulator repressing the gibberellin signal transduction pathway［J］．Plant Cell，1998，10(2):155-169．

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［7］Torres-Galea P，Huang Lifang，Chua N H，et al．The GRAS protein SCL13 is a positive regulator of phytochrome-dependent red light signaling，but can also modulate phytochrome A responses［J］．Mol Genet Genomics，2006，276(1):13-30．

［8］Achard P，Gong F，Cheminant S，et al．The cold-inducible CBF1 factor-dependent signaling pathway modulates the accumulation of the growthrepressing DELLA proteins via its effect on gibberellin metabolism［J］．Plant Cell，2008，20(8):2117-2129．

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［10］郭卫东，路梅，周春丽，等．佛手137Cs-γ射线辐射效应研究［J］．浙江农业科学，2006(1):31-33．

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［12］刘祖祺，张石诚．植物抗性生理学［M］．北京:中国农业出版社，1994:8-29．

［13］Lee M H，Kim B，Song S K，et al．Large-scale analysis of the GRAS gene family in Arabidopsis thaliana［J］．Plant Mol Biol，2008，67(6):659-670．

［14］郭华军．拟南芥转录因子GRAS家族SCL15基因对干旱胁迫的响应分析［D］．杨凌:西北农林科技大学生命科学院，2009:7-14．