蒋继志，王兴哲，王会仙

（1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北大学 图书馆，河北 保定 071002）

2种致病疫霉拮抗真菌混合发酵及抗菌物质稳定性研究

蒋继志1，王兴哲1，王会仙2

（1.河北大学 生命科学学院，河北 保定 071002；2.河北大学 图书馆，河北 保定 071002）

为获得防治马铃薯晚疫病稳定的生防制剂，对能够有效抑制致病疫霉的拮抗菌梨黑斑病菌LH-03和白菜黑斑病菌BH-09混合发酵的可行性及发酵条件进行了确定和优化，同时对混合发酵产物的抗菌稳定性进行了初步研究.结果表明，2种真菌之间无拮抗作用，可进行混合发酵，并且发现混合发酵后可有效提高2种真菌发酵液的抑菌活性；混合发酵的最佳发酵条件为pH 6.29，25℃、黑暗、静置、培养4d，在此条件下所得发酵产物对致病疫霉的抑菌率可达92.15%，显著高于2种拮抗菌单独发酵液的抑菌效果.混合发酵液经不同温度及不同pH值处理后，其抑菌活性基本保持不变或略有下降，其中在121℃高温处理下抑菌率仍可达到66.78%，在pH 2时抑菌活性最低，但仍达到了68.67%.混合发酵液中的抗菌物质具有很强的热稳定性及较强的耐强酸和强碱性，有良好的应用潜力.

致病疫霉；梨黑斑病菌；白菜黑斑病菌；混合发酵；拮抗物质

由致病疫霉（Phytophthorainfestans（Mont.）de Bary）引起的马铃薯晚疫病是马铃薯生产中最重要的病害，其危害性、防治难度及其对社会造成的影响已超过了水稻稻瘟病和小麦锈病，被视为国际第一大作物病害［1］.因此，对马铃薯晚疫病的生物防治也被提升到了一个新的高度.目前，对马铃薯晚疫病的生物防治主要利用微生物之间的拮抗［2］或预先处理诱导植物增强抗病性［3-4］等方法，其中拮抗实验多使用单一菌体进行抑菌作用的探讨，把2种或2种以上拮抗微生物进行混合发酵，在抑制致病疫霉方面国内外均鲜有报道［5-6］.本文在本实验室前期已明确梨黑斑病菌（Alternariaalternate）LH-03与白菜黑斑病菌（Alternaria brassicae）BH-09发酵液以一定比例混合后对致病疫霉的拮抗效果明显优于其单独发酵液的基础上［2］，对这2种真菌进行混合发酵的可行性、混合发酵条件及发酵产物中抑菌活性的稳定性方面进行初步研究，以期为生产中利用抗菌物质控制马铃薯晚疫病提供理论基础.

1 材料与方法

1.1 供试菌种

致病疫霉（Phytophthorainfestans（Mont.）de Bary）Z102、2种拮抗真菌（梨黑斑病菌（Alternariaalternate）LH-03和白菜黑斑病菌（Alternariabrassicae）BH-09）均为本实验室保存菌种.

1.2 2种拮抗真菌共培养的确定

将2种拮抗真菌在PDA平板上进行对峙培养，观察彼此之间有无拮抗作用，以确定能否共培养.

1.3 2种拮抗真菌混合发酵条件的确定

［2］所报道的方法并稍作修改制备2种拮抗真菌的复合发酵液，以打孔器分别打取在PDA上活化4～7d的梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌菌饼（φ＝7mm）各2个，一起放入100mL PDB（马铃薯蔗糖培养液）中，按培养时间、初始pH值、培养温度、光照、振荡与静置等不同单一条件进行混合发酵，分别获得发酵液，并通过抑菌实验逐一确定各项最佳培养条件.其中，培养时间分别为2，4，6，8，10，12，14，16d；培养基初始pH值分别为5.0，5.5，6.0，6.29（自然pH值），6.5，7.0，7.5，8.0；培养温度分别为20，23，25，27，30℃；光照条件分别为全黑暗、20h黑暗／4h光照、12h黑暗／12h光照、4h黑暗／20h光照；振荡条件分别为静置24h、振荡20min、静置20min和振荡24h；混合发酵液经离心、过滤除菌后于4℃保存备用或直接用涂布法［5］进行抑菌活性的测定.以上各项实验每种处理均重复3次，实验重复3次.

抑菌率＝（对照菌落直径-处理菌落直径）／对照菌落直径×100%.

1.4 混合发酵产物的最适抑菌质量浓度测定

利用上述已确定的最佳发酵条件获得混合发酵液，冷冻干燥后得混合发酵液干物质，用无菌水将其配制成不同质量浓度的溶液进行抑菌活性测定.

1.5 混合发酵液中抗菌物质对温度及pH值的敏感性测定

取最适抑菌浓度的混合发酵液5mL分装于5支离心管中，分别经不同温度（40，60，80，100℃水浴30min、121℃高温湿热灭菌30min）、不同pH 值（2.0，4.0，6.0，8.0，10.0）处理4h.高温处理后自然冷却至室温，pH值处理后再调回到原pH值，采用涂布法进行抑菌活性测定［5］，以未经处理的同浓度发酵液作为对照.

2 结果与分析

2.1 2种真菌混合发酵可行性的确定

对梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌进行对峙培养的结果表明，2种真菌之间无相互抑制作用，2者的菌丝之间无抑菌带（图1），确定可以进行混合发酵.

图1 梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌的对峙培养Fig.1 Dual-culture of A.alternate and A.brassicae

2.2 不同培养时间对混合发酵产物抑菌活性的影响

由图2和图3可以看出，不同培养时间对所得混合发酵产物的抑菌活性影响不同.在复合发酵的0～16 d中，除培养时间为2d和12d的发酵液抑菌活性较低外，其余培养时间所得发酵液对致病疫霉菌丝生长的抑制率均达到65%以上，其中培养4d所得的抑菌率最高（91.96%），致病疫霉菌丝几乎不生长；培养6d和10d所得的抑菌率次之，也均达到85%以上，以下各项实验中混合发酵时间均为4d.

图2 培养时间对混合发酵产物抑菌活性的影响Fig.2 Effect of culture time on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

图3 培养时间对混合发酵产物抑菌活性的影响Fig.3 Effect of culture time on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

2.3 不同初始pH对混合发酵产物抑菌活性的影响

不同初始pH对混合发酵产物抑菌活性的影响见图4，总体表现为混合发酵产物对致病疫霉菌丝生长的抑制作用在偏酸性条件下（抑菌率均高于60.19%）比在偏碱性条件下强，混合发酵的pH越接近原始发酵液pH抑菌效果越显著，以在原始pH（6.29）时抑菌率达到最高，为92.11%（图4）.以下各项实验中混合发酵的初始pH值确定为6.29.

图4 初始pH对混合发酵产物抑菌活性的影响Fig.4 Effect of initial pH on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

2.4 不同培养温度对混合发酵产物抑菌活性的影响

实验中测定了不同培养温度对混合发酵产物抑菌活性的影响（图5）.结果表明，在20～25℃内所得混合发酵产物随温度升高抑菌率逐渐增加并达到最高，抑菌率由52.48%升至90.85%，但温度继续升高至27℃或30℃时，抑菌率急剧下降（不到20%）.以下各项实验中混合发酵的培养温度确定为25℃.

图5 发酵温度对混合发酵产物抑菌活性的影响Fig.5 Effect of fermentation temperature on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

2.5 振荡／静置培养对混合发酵产物抑菌活性的影响

振荡或静置培养对混合发酵产物的抑菌活性有显著影响（图6），在24h连续静置和24h连续静置中只振荡20min的条件下，所得混合发酵产物的抑菌率可分别达到91.48%和84.26%，相反，在24h连续振荡和24h连续振荡中只静置20min的条件下，所得混合发酵产物的抑菌率仅分别为9.26%和3.33%.以下各项实验中混合发酵均在24h静置条件下进行.

2.6 光照／黑暗培养对混合发酵产物抑菌活性的影响

光照或黑暗培养对混合发酵产物的抑菌活性也有显著影响.由图7可见，在24h连续黑暗、20h黑暗／4h光照以及12h黑暗／12光照条件下，所得混合发酵产物的抑菌率可分别达到91.11%，86.11%和55%，而在4h黑暗／20h光照及24h连续光照条件下，所得混合发酵产物均无明显的抑菌作用，抑菌率不到3%.因此混合发酵实验宜在24h连续黑暗的条件下进行.

至此，2种拮抗真菌的最佳混合发酵条件确定为：初始pH 6.29在25℃黑暗中静置培养4d.

图6 振荡条件对混合发酵产物抑菌活性的影响Fig.6 Effect of vibration condition on anti-fungi activity of mixed ferment liquid

图7 光照条件对混合培养抑菌活性的影响Fig.7 Effect of lightness condition on the anti-fungi activity of mixed ferment liquid

2.7 混合发酵产物的最适抑菌浓度确定

利用上述已确定的最佳混合发酵条件进行混合发酵，获得的混合发酵液经冷冻干燥得到其干物质质量浓度为7mg／mL，用无菌水分别配制成6.3，4.9，3.5，2.1mg／mL和0.7mg／mL等质量浓度的溶液后进行了抑菌测定.结果显示，在用量相同但质量浓度不同时对致病疫霉菌丝生长有显著不同的影响（表1）.供试6种不同质量浓度的发酵产物，其抑菌率均在52%以上，均与对照达到极显著差异；且随发酵产物质量浓度增加，抑菌率逐渐升高，至最高质量浓度（7mg／mL）时抑菌率也达到最高（92.15%）.从经济实用等角度综合考查不同质量浓度混合发酵液的抑菌效果，可见混合发酵产物的最适抑菌质量浓度为2mg／mL.

表1 不同质量浓度混合发酵产物的抑菌作用Tab.1 Inhibition rate of different mass concentration mixed fermentation

2.8 不同温度处理对发酵产物抑菌活性的影响

不同温度处理对发酵产物中抑菌物质活性的影响见图8.总体上随处理温度升高抑菌物质的活性呈逐渐下降的趋势，但抑菌率均在66%以上.其中以121℃高压灭菌30min后抑菌活性下降幅度最大，与未进行高温处理的对照相比，降低了约26.9%，但其抑菌率仍达到了66.78%，仍保留有对照73.2%的抑菌活性；表明混合发酵液中抑菌物质具有很强的热稳定性.

图8 温度对混合发酵液中抗菌物质活性的影响Fig.8 Effect of temperature on the stability of the antagonistic substance produced by mixed fermentation

2.9 不同pH处理对发酵产物抑菌活性的影响

由图9可见，不同pH处理对所得发酵产物抑制致病疫霉菌丝生长的活性均有一定影响，与未进行pH处理的对照（抑菌率90.96%）相比，抑菌率虽均有所降低，但均在68%以上，表明混合发酵产物具有较好的耐强酸和强碱性质.

图9 pH对混合发酵液中抗菌物质活性的影响Fig.9 Effect of pH on the stability of antagonistic substance produced by mixed fermentation

3 讨论

利用拮抗微生物及其发酵产物抑制植物病原菌从而控制植物病害已有多年的研究历史，并由此已开发出一些生防制剂用以植物病害的有效防治［7］.但单一微生物发酵产物的作用强度、稳定性等均有一定的局限性，导致许多生防制剂在室内、盆栽或温室中防病效果十分突出，在田间却受到极大限制甚至没有防病效果［8］.因此，将不同拮抗微生物单独发酵后的产物混合或直接将不同拮抗微生物进行混合发酵，借助于发酵过程使不同拮抗微生物的发酵产物能够互补、协同或增效，获得混合发酵产物有可能是解决这一突出问题的途径之一［8］.微生物混合发酵在农业、工业、医药、环保、食品、酶制剂［9-10］等方面均有广泛应用，但在生物防治中报道还不多见.田黎等［11］将2株抑菌范围不同的海洋微生物菌株，进行混合发酵条件优化，结果有效地提高了菌株产生代谢产物的抑菌活性，其抑菌活性比单独发酵提高了200%，证明了2个不同菌株混合发酵的协同效应大于单独发酵混合后的累加效应，对靶标真菌的致畸作用明显；朱峰等［12］对2株南海红树内生真菌的混合发酵实验也充分证明了混合发酵技术有可能成为寻找新颖代谢产物的有效途径；葛红莲等［13］在复合菌剂AR99防治辣椒青枯病研究中，发现复合菌的防效高于任何一株单一菌株，可达91.1%；本研究室前期的研究也表明拮抗真菌和放线菌的发酵产物复配［5］、不同拮抗放线菌进行混合发酵所得产物［6］对致病疫霉的抑制作用也均显著优于拮抗菌单一发酵的抑菌效果；其中郭会婧等［2］发现梨黑斑病菌LH-03和白菜黑斑病菌BH-09单独发酵的产物混合后抑菌效果明显优于单一发酵产物，在质量浓度为10mg／mL时，2种菌发酵液的单独抑菌率分别为74.8%和67.8%，而等体积混合后的抑菌率为89.8%，表明2种拮抗菌的发酵产物混合后可能产生了协同或增效作用［5］.本实验将这2种拮抗菌混合发酵后，所得产物在较低质量浓度（7mg／mL）下的抑菌率为92.15%，明显高于上述郭会婧等报道的2种菌发酵液混合后（质量浓度为10mg／mL）的抑菌率（89.8%），表明梨黑斑病菌和白菜黑斑病菌混合发酵后更具有优势.但对于混合发酵所得产物的抗菌机制以及抑菌物质的性质等均有待进一步深入研究，以便为今后利用该抗菌物质奠定基础.

参 考 文 献：

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［3］蒋继志，史娟，赵丽坤，等.几种植物提取物诱导马铃薯对致病疫霉的抗性［J］.植物病理学报，2001，31（2）：145-151.

［4］蒋继志，孙琳琳，郭会婧，等.几种微生物提取物诱导马铃薯抗晚疫病及机理的初步研究［J］.植物病理学报，2010，40（2）：173-179.

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Mixed Fermentation of Two Antagonistic Fungi AgainstPhytophthorainfestansand Stability of Anti-fungi Substances

JIANG Ji-zhi1，WANG Xing-zhe1，WANG Hui-xian2
（1.College of Life Sciences，Hebei University，Baoding 071002，China；2.Library，Hebei University，Baoding 071002，China）

To obtain the stable biocontrol preparation for controlling potato late blight，the feasibility of mixed fermentation for antagonistic fungiAlternariaalternateLH-03andA.brassicaeBH-09against growth ofPhytophthorainfestansand the fermentation conditions were investigated，and then the stability of antagonistic substance in fermentation filter was tested in this experiment.The results showed that there were no antagonistic effects for two antagonistic fungi.The mixed fermentation could increase the anti-fungi activity toP.infestans.The optimized conditions for mixed fermentation were pH 6.29，25℃，standing culture for 4days in the dark.Inhibition rate of fermentation liquid at optimized condition was up to 92.15%and stronger than that of two fungi fermentation independently.The fermentation product at optimized condition after treatment with different temperature and pH，its anti-fungi activity remained basically unchanged or declined slightly，especially for the inhibitory rate could reach 66.78%with high temperature treatment at 121℃，and 68.67%with pH 2treatment，respectively.It is indicated that the fermentation product at optimized condition had a great potential in control potato late blight in future since it displayed strong thermal stability and well resistance to superacid and strong alkali.

Phytophthorainfestans；Alternariaalternate；Alternariabrassicae；mixed fermentation；antagonistic substances

Q 945.8

A

1000-1565（2011）05-0515-07

2011-02-12

河北省自然科学基金资助项目（C2011201003）

蒋继志（1960-），男，宁夏中宁人，河北大学教授，博士生导师，主要从事植物病理方面的研究.

E-mail：jiangjizhi＠yahoo.com

赵藏赏）