李 鹤(综述)，魏志平，刘彦群※(审校)

(1.泰州市人民医院北院皮肤科，江苏泰州225300;2.徐州医学院附属医院皮肤科，江苏徐州221002)

黑素瘤是起源于痣细胞和黑素细胞的人类恶性肿瘤，常规放化疗对其治疗效果欠佳，进展迅速，预后极差。如何使黑素瘤对化疗药物敏感、提高黑素瘤的治疗有效率是当今研究的主要目标。随着分子生物学、免疫学、细胞生物学等学科的发展，人们对黑素瘤发生的分子机制和信号转导途径的认识逐步加深，生物治疗以其比传统治疗有更好的靶向性与特异性的特点成为极有发展前景的方法。当前用于黑素瘤的生物治疗方法大致有基因治疗、免疫治疗、针对肿瘤血供的治疗等。现就生物治疗在黑素瘤治疗中的研究和应用予以概述。

1 基因治疗

基因治疗是指采用特定方式关闭、抑制异常表达基因，或通过在特定靶细胞中表达该细胞本来不表达或低表达的基因，达到治疗疾病目的的治疗方法，也就是“以基因作为靶点的治疗”。黑素瘤的发生发展与多个致癌基因和抑癌基因的突变有关［1］，包括Ras信号通路中的 c-Kit、Nras、Braf、MEK、磷脂酰肌醇 3 激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)等基因的高表达和PTEN基因的低表达，制约肿瘤生长的细胞周期依赖性激酶抑制基因(CDKN2A)信号通路中抑癌基因CDKN2A的低表达，以及调控细胞凋亡的Bcl-2/p53信号通路中的基因改变。以这些突变基因为靶点的基因疗法为黑素瘤的治疗提供了有力的武器。

1.1 RNA干扰技术在黑素瘤基因治疗中的应用RNA干扰［2］是指由于目标mRNA降解或翻译抑制所引起的转录后基因沉默。小分子干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)即含21～23个碱基的单链或双链RNA，可以通过RNA干扰，高效、特异地阻断体内同源基因表达，促使同源mRNA降解，诱使细胞表现出特定基因缺失的表型。SiRNA主要由3种方式导入细胞:siRNA表达框直接导入、质粒介导和病毒介导。在黑素瘤的基因治疗中SiRNA主要靶向于各种类型活化癌基因的mRNA。O'Connell等［3］发现应用siRNA沉默孤立酪氨酸激酶受体Ror2可以抑制由Wnt5A介导的黑素瘤细胞的转移。Singh等［4］通过短发夹RNA转染剔除了A375人黑素瘤细胞CXCR1和(或)CXCR2(均为CXC趋化因子家族的CXC-8受体)的功能，体外试验发现黑素细胞的增殖、存活、迁移和侵袭潜力受到抑制;裸鼠皮下移植瘤模型在生长、增殖及微血管密度等方面显著受抑，黑素瘤细胞凋亡显著增加。

1.2 miRNA在黑素瘤基因治疗中的作用microRNA(miRNA)是一类长度为19～25个核苷酸的非编码单链小分子RNA，通常在转录后水平调控基因表达。miRNA基因先转录成初级产物(pri-miRNA)，在核内被RNaseⅢ内切酶家族的Drosha酶切割成70个核苷酸左右的发夹状前体(pre-miRNA)。后者由胞核进入胞质，经Dicer酶作用生成18～24 nt的双链 RNA，只有其中一条链(成熟的 miRNA)与miRNA诱导沉默复合体稳定结合形成复合物。miRNA通过与靶向mRNA的3'末端非翻译区不完全碱基配对来调控靶mRNA降解或阻遏其转录后翻译［5］。miRNA有各种不同的功能，既可以是肿瘤抑制因子也可以是癌基因。已知在黑素瘤发生、发展过程中起不同作用的miRNA有:miR-137阻遏MITF表达，在黑素瘤中表达减少;miR-182过表达可使黑素瘤细胞的侵袭性增加;miR-221和miR-222可以下调c-Kit受体表达、阻遏p27基因表达，促进黑素瘤增殖;miRNA let-7，其主要靶基因是Ras，肿瘤发生的最初机制之一就是miRNA let-7表达减少;let-7家族中的let-7b可以直接或间接地靶向细胞周期调控，从而负性调节黑素瘤细胞生长和增殖;let-7家族中的另一成员let-7a可直接阻遏整联蛋白β3，减少黑素瘤细胞的转移和侵袭［6］。

1.3 靶向基因-病毒治疗在黑素瘤治疗中的应用靶向基因-病毒治疗是由刘新垣院士最先提出的结合基因治疗和病毒治疗优点的抗癌新策略［7］。携带治疗基因的肿瘤特异性增殖腺病毒对正常细胞和组织没有破坏作用或影响较小，只在肿瘤细胞内特异性的大量复制，保留了病毒杀死癌细胞的能力;同时随着病毒的复制，抗癌基因在肿瘤细胞中的表达量大大增加，进一步提高了治疗效果［7］。Zheng 等［7］将携带ZD55-IL-18的质粒与含有腺病毒右臂的质粒pBHGE3共转染293细胞获得重组腺病毒ZD-55-IL-18，可在黑素瘤细胞中高效表达IL-18基因，并能抑制黑素瘤细胞生长。实验证明，靶向基因-病毒可以增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性、提高化疗有效率，Jiang等［8］联合应用ZD55-IL-24与DTIC治疗黑素瘤在体外实验中取得了比单用更好的治疗效果。令人兴奋的是靶向基因-病毒还可以与RNA干扰技术结合应用，Zheng等［9］应用荷载端粒酶反转录酶(human telomeras ereverset ranscrip tase，hTERT)基因小干扰RNA的条件增殖型腺病毒(ZD-hTERT)在对肾癌的体内和体外试验中发现病毒特异性在肿瘤细胞内复制，有效沉默了肾癌的hTERT基因，抑制其增殖、促进其凋亡。这提示可以联合RNAi技术构建与黑素瘤有关癌基因的小干扰RNA插入病毒基因组中，为黑素瘤治疗提供新的思路。

2 免疫治疗在黑素瘤治疗中的应用

黑素瘤的发病与免疫逃避、免疫耐受密切相关。免疫治疗的目的是激发或调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境的抗肿瘤免疫力，从而控制和杀伤肿瘤细胞［10］。黑素瘤免疫治疗方面研究较多的主要有细胞因子治疗、过继性细胞治疗及黑素瘤的疫苗治疗等几种。

2.1 细胞因子治疗 干扰素α是第一个接受对转移性黑素瘤疗效评估的细胞因子，在Ⅱ期临床试验中有效率为5%～15%。在多个干扰素α与化疗药物合用的随机临床试验中发现联合应用并不能增强对转移性黑素瘤的疗效，因而不被推荐应用于Ⅳ期黑素瘤。目前干扰素α主要是作为佐剂用于高风险黑素瘤的治疗［11］。

IL-2是美国食品药物管理局唯一批准的用于治疗Ⅳ期黑素瘤的细胞因子。可以促进T淋巴细胞的增殖与分化，有着广谱的免疫增强活性，还可诱导外周血单个核细胞活性，从而产生抗肿瘤作用［12］。但因其毒性反应严重［13］，IL-2只限专门治疗机构有经验的医师应用于的器官功能良好的患者身上。

IL-15和IL-21与IL-2有序列同源性，IL-15在抗IL-2中和抗体存在时刺激IL-2依赖的T细胞增殖，IL-21对CD81+T细胞和CD41+T细胞都有作用，活化的IL-21受体可使T细胞增殖、分化，还可激活细胞因子和趋化因子;IL-15和IL-21可以发挥协同作用产生好而持久的抗原特异的CD81+T细胞反应［12，14］。IL-21作为单药治疗已进入黑素瘤Ⅰ期和Ⅱ期临床试验［15，16］。

2.2 过继性细胞治疗 过继性细胞是指经分离、体外激活并回输的肿瘤特异性或非特异性杀伤细胞。过继性细胞治疗绕过了机体免疫系统对肿瘤抗原的免疫耐受效应，通过向体内回输经体外扩增活化的过继转移免疫细胞，靶向肿瘤进行治疗［17］。主要包括淋巴因子激活的杀伤细胞过继免疫治疗和肿瘤浸润性淋巴细胞过继免疫治疗。

淋巴因子激活的杀伤细胞由大剂量IL-2体外活化外周血单个核细胞产生，可提高IL-2治疗黑素瘤的疗效［18］。肿瘤浸润性淋巴细胞由肿瘤组织中分离出的T细胞在体外经抗CD3单克隆抗体、IL-2激活产生。近年来，研究发现对肿瘤患者先进行免疫抑制预处理，再输给经过体外筛选扩增的自体肿瘤浸润性淋巴细胞可明显提高对转移性黑素瘤的治疗效果［19］。

2.3 黑素瘤的疫苗治疗 肿瘤疫苗是直接应用肿瘤抗原进行主动免疫治疗的一种方法，目标是诱导细胞毒T淋细胞对抗原递呈细胞表面人类白细胞抗原Ⅰ型分子上肿瘤抗原的识别，活化CD4+辅助 T细胞，发挥免疫记忆功能。目前Ⅲ期临床试验报道的黑素瘤疫苗有MSMM-1和MSMM-2的裂解物Melacine、黑素瘤相关抗原 CanVaxin、黑素瘤相关抗原vitespen和树突状细胞［20］。2005年2月美国食品药物管理局批准了树突状细胞疫苗DC-MelVac疫苗用于Ⅳ期黑素瘤患者的治疗［21］。美国国立癌症研究所外科总结了9年内用各种不同肿瘤疫苗治疗440例癌症患者(其中黑素瘤患者422例)的情况，总客观有效率为 2.6%［22］。

3 针对肿瘤血液供应的治疗在黑素瘤治疗中的应用

肿瘤的生长、代谢、浸润转移和复发均与肿瘤的血液供应密切相关。黑素瘤独特的血液供应方式和多种血管生成因子的分泌是其生长迅速、转移早、恶性度高的原因之一。

3.1 血管生成拟态 1999年 Maniotis等［23］在研究葡萄膜黑素瘤微循环时发现黑素瘤细胞通过自身变形形成可输送血液的管道结构，称为血管生成拟态。该血管管道的特点是管道内没有血管内皮细胞衬覆，肿瘤细胞模仿机体血管生成而形成瘤细胞条索并围成管道，其中有血液流动［24］。血管生成拟态是黑素瘤在血管生成外的另一种获得血液供应的方式，其调节与基因、血管上皮钙黏素、Twist1细胞核的表达等相关。血管生成拟态是预后不良的标志，采用经典抗血管治疗联合抗血管生成拟态治疗已成为抗肿瘤治疗的必要手段［25］。

3.2 血管内皮生长因子 血管生成是黑素瘤侵袭、转移过程中的关键环节，其间涉及包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、血管抑素、纤维蛋白生长因子等在内的多种细胞因子［26］。其中VEGF作为已知最强的血管渗透剂和内皮细胞特异的有丝分裂原，在内皮细胞增殖、迁移和血管构建中起重要作用［27］。Salven等［28］发现 32%的原发性黑素瘤表达VEGF，而在转移性黑素瘤中VEGF表达率高达91%。VEGF的主要功能包括:①促进血管内皮细胞增殖和新生血管的形成;②增加血管通透性，引起细胞外基质改变，为肿瘤生长、浸润及转移提供基础;③促进淋巴内皮细胞生长;④增加组织因子产生［27］。近年来以VEGF信号转导通路为靶点对抗血管生成也成为黑素瘤生物治疗的主要方向。Tao等［29］构建针对VEGF的siRNA评估它对黑素瘤 A375细胞增殖和凋亡的效果，发现VEGF表达下降后裸鼠移植瘤的微血管密度减少、肿瘤生长受到抑制、凋亡细胞增加。贝伐单抗是重组人源性VEGF单克隆抗体，可与人类各种VEGF高亲和性结合，阻断其介导的血管形成，从而有效地抑制肿瘤细胞生长和肿瘤转移。目前已有贝伐单抗联合化疗药物治疗Ⅳ期黑素瘤的Ⅱ期临床试验，取得了比各药物单用更好的疗效［30］。

4 结语

生物治疗可以针对性靶向肿瘤发生、发展中的某一环节，取得了令人鼓舞的治疗效果，现已成为继手术、化疗和放疗三大经典肿瘤治疗模式后的第四模式。目前化学治疗联合多种生物治疗频繁出现于黑素瘤Ⅱ期和Ⅲ期临床试验中，但总体效果尚不理想，黑素瘤仍为病死率很高的肿瘤，因此，如何提高生物治疗的疗效及安全性仍是未来研究的重点。随着分子生物学技术、基因工程技术的发展，以及对黑素瘤分子机制研究的更加深入，生物治疗必会成为黑素瘤综合治疗中不可缺少的组成部分。

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