李 覃，陈 虹，韦 娜，梅 昕，那春祺，刘永峰，胡 杰

(1.天津武警医学院免疫学教研室，2.天津市职业与环境危害生物标志物重点实验室，3.天津武警医学院生药学教研室，天津 300162)

接触性皮炎是皮肤和外物接触后诱发的急、慢性炎症反应，分为化学刺激引起的刺激性接触性皮炎(irritation contact dermatitis，ICD)和免疫反应引起的变应性接触性皮炎(allergic contact dermatitis，ACD)。对于ICD，找到病因避免接触则较易治愈;而对于ACD，由于许多患者不能圆满改善与变应原接触的现状，或者未得到正确的诊断与治疗，常导致病情迁延难愈。而且，随着经济和现代工业化的发展、环境污染的加重，ACD发病率呈逐年增高趋势。目前，ACD的常用治疗药物均有不同程度毒副作用，因此，研制疗效好、副作用小的新型干预药物就显得尤为迫切和重要。青蒿素(artemisinin，Art)是从菊科植物黄花蒿叶中提取的一种含有过氧基团的倍半萜内酯，在临床上已被广泛用于治疗疟疾，具有高效低毒的特点［1］。多年来的临床和实验室研究发现，青蒿素杀灭疟原虫的作用与其免疫调节活性相关［2］。现已证实，Art对类风湿性关节炎、红斑狼疮等自身免疫性疾病以及二硝基氟苯(2，4-dinitrofluorobenzene，DNFB)诱导的小鼠ACD都能显示出不同程度的治疗或保护作用，但具体作用机制尚未完全阐明。本实验在建立小鼠实验性ACD模型的基础上，局部外涂Art进行干预，通过检测Treg、Th17细胞特异性核转录因子、相关细胞因子以及信号分子，探索Art对ACD小鼠Treg/Th17免疫平衡的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料 Art(纯度99.5%)购于郑州荔诺生物科技发展有限公司;DNFB购于Sigma公司;TRIzol试剂购于Invitrogen公司;逆转录试剂盒购于Promega公司;小鼠Treg试剂盒购于eBioscience公司;STAT3及其磷酸化抗体phospho-STAT3(Ser727)购于Bioworld公司;Bradford蛋白浓度测定试剂盒、增强化学发光(enhanced chemiluminescence，ECL)试剂盒购于Pierce公司;IL-6、IL-10、IL-17的ELISA试剂盒购于R＆D公司;ICR小鼠(6～8周龄，♀)购于北京军事医学科学院实验动物中心，动物合格证SCXK-(军)2007-004。

1.2 动物模型的建立及给药方法 参照文献方法［3］建立ACD小鼠模型:实验前1日将每鼠腹部去毛，去毛范围约为3 cm×3 cm。开始日(d 0)和d 1每日于去毛部位涂0.5%DNFB(以4∶1丙酮橄榄油配制)40 μl分别致敏1次。d 6于左耳内外侧涂0.3%DNFB 20 μl激发。诱发前0.5 h和诱发后6 h小鼠左耳外涂Art乳膏(本室自制，Art浓度分别为2%、4%、8%)。激发后48 h处死小鼠。取一组模型小鼠外涂乳膏基质作为基质对照以排除基质对ACD的影响。

1.3 RT-RCR 检测 Foxp3、ROR-γt的 mRNA 表达

收集各组小鼠引流淋巴结，提取组织RNA，检测A260/A280比值在1.8～2.0。引物序列由金思特科技有限公司合成如下:Foxp3(424 bp):上游引物5'-ACGCCCCAACAAGTGCTCCA-3'，下游引物 5'-TGGCAGTGGCCAAGGCAGAT-3';ROR-γt(291 bp):上游引物5'-TGAACTTGGGGAACCAGAAC-3'，下游引物5'-TTGGCAAACTCCACCACATA-3';GAPDH(225 bp):上游引物5'-TGGAGAAACCTGCCAAGTATG-3'，下游引物 5'-CCCTGTTGCTGTAGCCGTAT-3'。按照Promega公司逆转录试剂盒说明进行cDNA合成。PCR扩增条件为:预变性94℃ 5 min，94℃ 30 s、55℃ 45 s、72℃ 30 s，共 34 个循环。扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后，应用Gel-Doc2000凝胶成像分析系统测定各组条带。

1.4 双抗体夹心ELISA检测IL-6、IL-10、IL-17含量 收集模型及给药干预各组小鼠耳组织，置于含0.1%Tween 20的PBS中匀浆，取上清，按试剂盒推荐的步骤，用双抗体夹心ELISA法检测细胞因子含量。

1.5 流式细胞术 按文献方法［4］收集、纯化各组小鼠淋巴结 T细胞，以 staining buffer洗涤 3次(2 000 r·min－1，5 min/次)，根据试剂盒推荐的步骤，以抗-CD4和抗-CD25抗体进行表面标记，4℃避光孵育30 min，洗涤3次，固定、破膜后加入抗Foxp3及相应的同型对照，4℃，避光孵育30 min，洗涤后以staining buffer重悬细胞，Backmen流式细胞仪上机分析。FITC为荧光1通道(FL1)，PE为荧光2通道(FL2)，PE-Cy5为荧光4通道(FL4)，采用SystemⅡTM软件进行数据分析。

1.6 Western blot检测STAT3的活性表达 收集各组小鼠淋巴结，提取组织蛋白，Bradford法定量蛋白含量，SDS-PAGE电泳，半干法转至PVDF膜，5%脱脂奶粉封闭，一抗(Phospho-STAT3，1∶1 000)孵育，4℃过夜，TBST洗膜后以辣根过氧化物酶标记的二抗(1∶2 000)室温孵育2 h，ECL法检测。用Stripping Solution洗脱、封闭后，再次加入一抗(STAT3，1∶1 000)、二抗，显影。采用 BioRad系统进行数据分析。

2 结果

2.1 Art调节Treg/Th17细胞特异性核因子的基因表达 Foxp3与ROR-γt分别是Treg细胞和Th17细胞的特异性标志和特异性转录因子，在相应T细胞亚群的分化过程中起重要作用［5］。为探讨Art对Treg/Th17免疫平衡的调节作用，采用RT-PCR检测Foxp3和ROR-γt的基因表达。Art作用后，Foxp3的mRNA表达增加，尤以中、高剂量组明显;同时ROR-γt的mRNA表达明显下降(Fig 1)。可见，在DNFB诱导的ACD小鼠中，Art能够通过影响Foxp3和ROR-γt基因表达抑制Th17细胞分化、诱导Treg生成，从而调节Treg/Th17免疫平衡。

Fig 1 Effect of artemisinin(Art)on the expression of Foxp3 and ROR-γt1:Marker;2:Normal;3:Vehicle;4:2%Art;5:4%Art;6:8%Art.Art:artemisinin;Normal:normal mice;Vehicle:vehicle group without Art.

2.2 Art对Treg/Th17细胞相关细胞因子产生的影响 ELISA检测结果显示(Fig 2)，与正常组比较，基质对照组IL-17含量明显增高，而IL-10则明显降低(P＜0.05)。Art作用后，Treg/Th17相关细胞因子的产生显示出不同程度的变化，与基质对照相比，Art能有效抑制IL-17的产生，且呈一定的剂量依赖性，然而 Art对 IL-10产生无影响(P＞0.05)。

2.3 Art对CD4+CD25+Foxp3+Treg亚群的调节作用 流式细胞仪检测结果可见(Fig 3)，高剂量Art作用后，CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞约占6.14%，与基质对照组(5.08%)相比明显升高，但中、低剂量Art则下调Treg的产生(P＜0.05)，提示高剂量Art对CD4+CD25+Foxp3+Treg亚群有促增殖效应，而中、低剂量的 Art则抑制 CD4+CD25+Foxp3+Treg的增殖分化。

2.4 Art抑制IL-6及Phospho-STAT3的活性表达

炎症部位IL-6含量的检测结果显示，高剂量Art明显抑制ACD小鼠的IL-6产生，中、低剂量组的差异无显著性(P＞0.05)。Western检测结果表明，Art能有效减弱p-STAT3的活性表达，同时不影响相应的非磷酸化抗体的蛋白表达(Fig 4)。

Fig 2 Effect of Art on IL-10 and IL-17A:The production of IL-17;B:The production of IL-10.＊＊P＜0.01 vs vehicle group

3 讨论

ACD的病理过程主要为T细胞介导的迟发型超敏反应。传统上根据分化和功能特征可将CD4+T细胞分为Th1和Th2细胞，正常情况下Th1/Th2免疫应答处于动态平衡，一旦该模式向Th1偏移时会发生炎症反应和组织损伤，ACD一度被认为与Thl型免疫反应相关。目前对ACD的发病机制仍存在不少争议，有研究发现下调Th1应答能够治疗ACD，但也有报道指出，可以通过纠正Th2偏移控制ACD［6－7］。最近研究表明，ACD 的细胞因子反应模式与过敏原类型、接触途径等因素有关，如在DNFB诱导的ACD中T细胞向Th1分化偏移，而异硫氰酸荧光素(FITC)诱导的ACD中T细胞则向Th2偏移［6］，因此ACD的发病过程可能同时涉及 Th1和Th2细胞，两者在疾病发展的不同阶段可能呈交互出现。

Fig 3 Effect of Art on the generation of Treg

以往研究报道，无论DNFB还是FITC诱导的ACD动物模型，CD4+T细胞都能降低ACD发生，然而对CD4+T细胞减弱过敏原引发炎症的原因尚不清楚，直到Sakaguchi等［8］发现和提出调节性 T细胞(regulatory T cell，Treg)的存在。现已明确，过激的免疫应答(如迟发型超敏反应)不仅有效应性T细胞活化，还伴随着Treg的形成，Treg和效应细胞之间的平衡是免疫系统控制免疫应答的关键，Treg功能低下甚至可以成为导致ACD发生的重要原因［9］。新近证实，抗炎剂可通过诱导Treg明显减轻小鼠的接触性超敏反应［10］。本课题组前期发现，Art不但对DNFB诱导的ACD小鼠耳肿胀有明显抑制效应，而且能够剂量依赖性地促进 TGF-β产生［11］。本实验进一步观察Art对Treg细胞的影响，发现Art能剂量依赖性地上调ACD小鼠的Foxp3表达。已有文献报道表明，较低剂量的Art能够增强小鼠T细胞介导的免疫应答，对免疫功能重建起到一定作用［12］;而高剂量Art则具有广泛的免疫抑制作用［13］。本研究结果提示，高剂量Art可以通过诱导Treg发挥免疫抑制作用，而较低剂量的Art则抑制Treg的产生，与文献报道相一致。可见，Art的这种双相免疫调节效应或许与药物剂量、给药途径以及机体状态等多种因素有关。

Fig 4 Inhibitory effect of Art on IL-6 level and phosphorylated-STAT3 expressionA:The production of IL-6;B:The expression of phosphorylated-STAT3.＊＊P ＜0.01 versus vehicle group.1:Normal;2:Vehicle;3:2%Art;4:4%Art;5:8%Art

Th17细胞是人们新近发现的以IL-17为主要效应因子的新型CD4+T细胞亚群，参与机体多种炎症和免疫性疾病的发生［14］。有报道指出，ACD患者皮损部位可见大量Th17细胞浸润、IL-17表达增加［5］。Th17的发现弥补了Th1/Th2介导ACD免疫效应机制的不足。IL-6是重要促炎因子，一般认为，IL-6和TGF-β是诱导初始CD4+T细胞向Th17细胞分化的关键细胞因子，两者同时存在时，会促进Th17细胞生成的正反馈环路，使初始T细胞向Th17细胞分化并产生 IL-17，后者进一步促进 IL-6的产生［15］。参与IL-17产生的一个重要的信号分子是信号转导子和转录激活子3(STAT3)，能被IL-6经由细胞膜受体gpl30/II-6Ra活化，进而与酪氨酸磷酸化信号通路偶联，发挥转录调控作用［16］。本实验及课题组前期研究结果显示［11］，Art明显抑制ACD小鼠高表达的 ROR-γt及 IL-17 的产生，上调 TGF-β，从而进一步促进Treg细胞的生成。另一方面，Art还能抑制IL-6水平及STAT3的活性表达，随着IL-6的降低，增加的TGF-β又能通过扩增、维持Treg细胞，将效应细胞的功能维持在合适状态，从而有效控制ACD的发病过程。

以往认为，ACD的免疫学发病机制主要是Th1细胞占优势的免疫应答，Th17细胞的发现拓宽了对ACD形成机制的认识，有助于解释Th1/Th2轴中异常现象发生的原因。Th17在分化和功能上能够与Treg相互转化，TGF-β可诱导初始 T细胞分化为Treg并抑制免疫应答;而在IL-6存在情况下，TGF-β则促进Th17细胞生成并分泌IL-17，促进炎症反应发生。可见，Th1/Th2细胞、Treg/Th17细胞及其相关细胞因子间免疫平衡的破坏对ACD的发生、发展具有重要作用，调控Treg/Th17之间的平衡，可能为有效治疗ACD提供一个新的途径。

总之，本研究显示Art具有良好的免疫抑制活性，对DNFB诱导的小鼠ACD具有保护作用，推测低浓度的TGF-β和IL-6的协同作用能诱导Th17细胞特异性核转录因子ROR-γt产生，增加Th17细胞数量;而高浓度TGF-β则上调Foxp3表达，影响IL-17产生进而抑制Th17细胞分化。据此认为，在DNFB诱导的ACD中，IL-6的明显增多使初始T细胞向Th17细胞分化，Art通过下调炎症组织中的IL-6、IL-17，抑制 ROR-γt表达，上调 TGF-β 与 Foxp3，从而抑制Th17细胞产生;另一方面，当Art干预后，TGF-β水平升高，IL-6水平降低，增高的 TGF-β可促使 Treg细胞增多、抑制 Th17细胞分化。同时Treg细胞还可抑制Th17细胞及IL-17的活性，使炎症反应减轻。此外，在Art阻止IL-6诱导Th17细胞并促进抗炎性Treg的分化中，其对STAT3信号途径的阻断似乎是关键因素，然而STAT3能否成为Art治疗ACD的有效靶位尚需进一步研究。

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