王烁 ，吴海文 ，邱志龙 ，汝海健 ，高美须 ，李淑荣 ，*

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室，北京 100193；2.沈阳产品质量监督检验院，辽宁 沈阳 110022）

改性处理对花生蛋白致敏性的影响

王烁1，2，吴海文1，邱志龙2，汝海健2，高美须1，李淑荣1，*

（1.中国农业科学院农产品加工研究所，农业部农产品加工与质量控制重点开放实验室，北京 100193；2.沈阳产品质量监督检验院，辽宁 沈阳 110022）

通过检测花生蛋白SDS-PAGE电泳及免疫印迹图谱研究不同改性处理对花生蛋白致敏性的影响。结果表明，物理方法及化学方法虽然能降低一定的致敏性，但效率不高。经转谷氨酰胺酶处理后63.2、53.2、47.4、41.6 ku的致敏蛋白含量及致敏性随加酶量的增加而降低。

改性；花生；致敏蛋白

食物过敏是食品安全的重要研究内容之一，引起国内外食品安全专家的高度关注。花生作为我国重要的油料和经济作物之一，是人们主要的食物来源和重要的食品加工原料。据报道花生过敏占食物过敏的10%～47%[1]，由于各民族的遗传因素的差异和饮食习惯的不同，引起过敏反应的原因也有所不同。流行病学研究表明在美国约有0.6%的人群，英国约有0.5%的人群对花生过敏[2]。在中国，对96例过敏性皮炎的诱因分析发现，其中12.5%是由食物过敏引起的，而对32例进行体外IgE检测发现6.3%对大豆/花生过敏[3]。但国内在花生致敏方面的研究较少，至今少有人做过系统的研究。

蛋白质改性是人为地对蛋白质结构进行修饰，从而改善产品的相容性和功能性。与蛋白质改性方法相类似，花生蛋白中过敏原的去除可根据原理不同，分为物理法、化学法、生化法、酶法、基因工程方法和育种学方法等，在食品领域中主要采用物理法、化学法和酶法。为保证花生制品的安全性，本研究采用的物理法主要涉及了加热、机械作用、声波、微波等方式，化学法主要是采用还原剂对蛋白进行结构修饰，酶法主要采用转谷氨酰胺酶对蛋白进行改性处理。本文通过SDSPAGE电泳及Western Blot免疫印迹判断致敏蛋白分布及致敏性的变化，探讨花生致敏蛋白的物化性质，旨在获得低致敏性的蛋白质，为花生脱敏方法的建立提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

花生浓缩蛋白：中国农业科学院农产品加工研究所，农业部辐照产品监督检验测试中心实验室自制；花生过敏患者血清（7例，中国医学科学院附属北京协和医院变态反应科）；转谷氨酰胺酶：TGase，100 U/g，江苏泰兴一鸣生物制品有限公司。

AE-8130型电泳仪、AE-6450型垂直电泳槽、AE-6675&AE-6675L型转移电泳槽：日本ATTO公司；KQ-200VDB型双频数控超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；HMS-350小型旋涡振荡器：天津市恒奥科技发展有限公司。

1.2 实验设计

1.2.1 物理处理

1）热处理

8%的花生浓缩蛋白溶液，80℃水浴6 min，冷却至室温，冷冻干燥。

2）高速搅拌

8%的花生浓缩蛋白溶液，12000 r/min搅拌60 s，冷冻干燥。

3）超声辐射

8%的花生浓缩蛋白溶液，悬浮液置于超声波发生器内，超声仪探头浸入液面2 cm，1000 W超声6 min，冷冻干燥。

4）微波辐射

8%的花生浓缩蛋白溶液，功率800 W微波辐射30 s，冷冻干燥。

1.2.2 化学处理

1）还原剂-1处理

9.6 %的花生浓缩蛋白溶液（pH7.0）5 mL，加入1 mL 0.625 mmol/L的还原剂-1溶液，30℃振荡90 min，冷冻干燥。

2）还原剂-2处理

9.6 %的花生浓缩蛋白溶液（pH7.0）5 mL加入试管中，加入1 mL 0.75 mmol/L的还原剂-2溶液，30℃振荡120 min，冷冻干燥。

1.2.3 酶处理

花生浓缩蛋白溶于pH7.0的Na2HPO4-NaH2PO4缓冲液中，配制成15%（g/mL）的溶液，搅拌2 h，每克蛋白质分别添加 1、2、3、4、5、7.15、8.75、12.5、16.25、18.81U转谷氨酰胺酶，50℃反应1h，保鲜膜封口，90℃下处理15 min，流动水快速冷却，4℃冰箱保存14 h[4]。

1.3 方法

1.3.1 花生浓缩蛋白的制备

以脱脂花生蛋白粉为原料，料液比1:11（g/mL），36℃85%乙醇浸提60 min；1500 r/min离心10 min；沉淀用8倍97.5%乙醇，38℃浸提30 min，1500 r/min离心10 min去除上清液，40℃鼓风干燥90 min，得花生浓缩蛋白（PPC）。

1.3.2 花生粉中蛋白的提取

花生粉2.0 g溶解于40 mL 0.01 mol/L pH7.2的PBS缓冲溶液中，振荡提取2 h，于4℃离心（15000r/min,15 min），取上清液待用，即花生粉溶液。

1.3.3 酶处理后花生粉中蛋白的提取

酶处理后花生粉2.0 g，溶解于40 mL 0.01 mol/L pH8.8的Tris-HCl缓冲溶液中，振荡2 h，9000 r/min 4℃离心20 min，取上清液待用。

1.3.4 酶活力测定

酶活力测定采用SB/T 10317-1999蛋白酶活力测定法。

1.3.5 SDS-PAGE电泳

1）十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDSPAGE），13.5%分离胶，5%浓缩胶。

2）将花生蛋白溶液与2×SDS样品缓冲液混合，煮沸，离心数秒，静置。

3）将处理过的样品和标准分子量Marker用微量加样器加到梳孔中。

4）120 V恒压电泳，至溴酚蓝前沿到达凝胶下边界，停止电泳，取出凝胶，固定染色。

1.3.6 电转移（半干式）

1）将硝酸纤维素膜作上标记，与SDS-PAGE凝胶的大小一样。再将大小相同的6张滤纸每3张一组，分别浸泡在阳极及阴极电极缓冲液中。

2）将电泳完毕的SDS-PAGE凝胶取下，放入电转缓冲液中平衡20 min～30 min。按以下顺序铺于阳极上：3层阳极滤纸→NC膜→凝胶→3层阴极滤纸，轻轻压紧“凝胶三明治”，盖上盖子，降低并锁定负极。

3）定流 96 mA/gel，电转移 2.0 h。

4）电转移结束后，NC膜用丽春红溶液染色5 min，脱色5 min，观察转印效果及蛋白质位置，进行免疫印迹。

1.3.7 免疫印迹

1）转印后的NC膜漂洗，封闭。

2）NC 膜与合适浓度的第一抗体（1:2.5～1:5）室温下孵育过夜。

3）NC膜与合适浓度的HRP（辣根过氧化物酶）标记的鼠抗人IgE（酶标记过的1:200稀释）于37℃孵育2 h。

4）漂洗后的NC膜浸没在底物溶液中显色，待蛋白带显色清晰，终止反应。

5）用去离子水冲净NC膜，夹于双层滤纸中风干保存。

1.3.8 SDS-PAGE及Western Blot结果分析

采用FlourChemV2.0凝胶成像分析软件（America）分析。

7例血清与花生蛋白反应变化程度基本相同，仅以其中最为明显一例进行说明。

2 结果与讨论

2.1 物理处理对花生致敏蛋白的影响

物理及化学处理对花生致敏蛋白的影响见图1。

图1 物理及化学处理对花生致敏蛋白的影响Fig.1 Effect of physics and chemistry process on allergic proteins of peanut

从图1中可看出，花生蛋白粉出现20余条深浅不一的蛋白区带,分子量主要介于14.6 ku～96.9 ku之间。其中有10条带蛋白含量较多,分子量分别为63.2、37.5、34.3、30、23.6、22.5、20.2、18.6、17.6 和 8.19 ku,又以 63.2、20.2、18.6、17.6 和 8.19 ku等 5个区带蛋白含量最丰富。据报道，食物过敏原为具有酸性等电点的蛋白质或糖蛋白，分子量在10 ku～70 ku[5]。研究中发现有 63.2、53.2、47.4、41.6、39.3、34.3、30.0、23.6、20.2、18.6、17.6和14.6 ku,共12条蛋白带的分子量与花生致敏蛋白相近[6]。

对于过敏原为蛋白质的食品，高温处理会破坏蛋白质空间构象，进而会一定程度的降低食品的致敏性。例如，病人对冻干的蛋清蛋白过敏，却对经过烹调的蛋清蛋白不过敏[7]。高速搅拌过程中，高速剪切作用使蛋白质大分子聚集体破碎，即打断蛋白分子间的较弱的作用力，如氢键，范德华力等，同时增加原先包埋在分子内部的致敏基团的暴露机会，从而有可能改变花生蛋白的致敏性。此外，Ryo Nakamura[8]利用超声波处理浸泡过的大米，结果去除了90%的致敏蛋白，而其他蛋白没有明显损失。超声波在介质中传播时，会产生热效应，机械效应或空化效应，引起介质的一些特性发生改变。但从图1可以看出，热处理、高速搅拌、超声辐射对花生致敏蛋白分子量及致敏性均无明显影响，与Ryo Nakamura等研究的结论有所不同，这可能与原料有关。

由图1可知，微波辐射未改变花生致敏蛋白的分子量分布，但明显降低了63.2、30 ku蛋白的致敏性。微波能是一种由离子迁移和偶极子转动而引起分子运动的非离子化辐射能，当它作用于分子时，可促进分子的转化运动，产生键的振动、撕裂和粒子间的摩擦和碰撞，并迅速生成大量的热能，促使分子间和分子内部的非共价键，-S-S-等断裂，部分包裹于分子内部的不溶性蛋白分子释放出来并扩散至溶剂中，蛋白的游离巯基含量和表面疏水性指数增大，从而使蛋白的致敏性发生一定程度的改变。

2.2 化学处理对花生致敏蛋白的影响

二硫键存在时，致敏蛋白具有致敏性。二硫键被硫氧降解为硫氢基后，致敏蛋白的致敏性就会消失。Aminlari M等在研究中发现在蛋白中添加一定量的还原剂，例如NaSO3和Cys（半胱氨酸），是改变二硫键从而改善蛋白PDI的有效方法。Fukushima D等在研究中也得出了类似的结论。由于NaSO3和Cys都是对二硫键有特异性的还原剂，因此一些学者将这一结果解释为还原剂的使用打破了蛋白中的二硫键，也就是说，导致蛋白质溶解度下降的原因是二硫交联。因此，本研究也考察了还原剂的添加对蛋白致敏性的影响，试图利用还原剂处理蛋白来降低其致敏性，但从图1中可以看出，还原剂-1及还原剂-2都未改变花生致敏蛋白的分子量分布。

总体来讲，物理方法及化学方法虽然能降低一定的致敏性但效率不高。蛋白分子上的抗原决定簇（表位）有空间表位和线性表位2种，物理及化学2种变性方式只在一定程度上破坏了空间表位，但线性表位却很难遭到破坏。

2.3 酶处理对花生致敏蛋白的影响

利用微生物或酶制剂催化蛋白质发生化学反应属于生物改性，可以改变蛋白质的基本结构，同化学反应相比它的反应专一、条件缓和、易于控制，越来越受到人们的重视。转谷氨酰胺酶是一种可以导致蛋白质（或多肽）之间发生共价交联形成共价化合物的聚合酶。

酶处理对花生致敏蛋白的影响见图2。

图2 酶处理对花生致敏蛋白的影响Fig.2 Effect of enzyme polymerization on allergic proteins of peanut

从图2可以看出，随转谷氨酰胺酶加酶量的增加，中低分子量的蛋白逐渐聚合成大于175 ku的蛋白，63.2、53.2、47.4、41.6 ku 的致敏蛋白含量及致敏性逐渐降低。这可能是由于蛋白在交联与聚合的过程中，抗原决定簇的结构发生了掩盖或改变，或普遍提高了免疫原性，从而影响了致敏能力。El fadilE[9]等对大豆蛋白致敏性研究时，也发现了类似的情况。

3 结论

物理方法及化学方法虽然能降低花生蛋白一定的致敏性但效率不高。随转谷氨酰胺酶加酶量的增加，中低分子量的蛋白逐渐聚合成大于175 ku的蛋白，63.2、53.2、47.4、41.6 ku 的致敏蛋白含量及致敏性逐渐降低。

由于反应的复杂性，使加工处理过程中增加或者降低抗原蛋白的致敏性都有着可能，抗原在加工存储过程中不仅有被破坏的可能，同样也有形成新抗原的可能，因此如何控制反应条件并保证食品的安全性还有待进一步研究。

[1]Roland E Poms,Claudia Capelletti,Elke Anklam.Effect of roasting history and buffer composition on peanut protein extraction efficiency[J].Mol Nutr Food Res,2004,48:459-464

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Effect of Modified Process on the Allergenic Property of Peanut Proteins

WANG Shuo1，2，WU Hai-wen1，QIU Zhi-long2，RU Hai-jian2，GAO Mei-xu1，LI Shu-rong1，*
（1.Institute of Agro－food Science and Technology，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Key Laboratory of Agricultural Product Processing and Quality Control，Ministry of Agriculture，Beijing 100193，China；2.Shenyang Product Quality Supervision and Inspection Institute，Shenyang 110022，Liaoning，China）

The effect of different modified process on allergic peanut proteins has been studied by detection of peanut protein SDS-PAGE and Western Blot patterns.Results showed that the majority of peanut proteins kept stable against physical and chemical modified.With the increase of enzyme transglutaminase,content of 63.2,53.2,47.4 and 41.6 ku allergenic protein and the allergenicity reduced gradually.

modified;peanut;allergic protein

中国农业科学院院所创新基金

王烁（1983—），女（汉），助理工程师，硕士，主要从事生物化学及食品辐照技术的应用和研究。

*通信作者

2010-08-24