朱晓立，梁世中，邓毛程，朱明军

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东 广州 510300；2.华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510640）

pH-stat控制流加培养红发夫酵母产虾青素

朱晓立1，梁世中2，邓毛程1，朱明军2

（1.广东轻工职业技术学院食品与生物工程系，广东 广州 510300；2.华南理工大学生物科学与工程学院，广东 广州 510640）

通过酸碱流加培养、混合碳源-氨水流加培养、混合碳源-尿素流加培养等pH-stat控制流加培养红发夫酵母产虾青素。pH-stat控制流加培养与分批培养相比较，生物量及虾青素产量都有不同程度地提高。从提高虾青素产量和降低生产成本综合考虑，混合碳源-氨水流加培养是最理想的方法，培养96 h虾青素产量最高达到19.94 mg/L。

红发夫酵母；虾青素；pH-stat；流加培养

色素与食品的关系密不可分，色素赋予食品诱人的色泽，从而给消费者带来良好的感官质量和强烈的购买欲。食用色素按来源可分为天然和人造色素两大类。近年来发现人工化学合成色素有的存在致癌和致突变作用，故天然色素日益受到人们重视，而开发具有一定营养价值或药理作用的功能性天然色素，是色素工业发展的重中之重。

虾青素是一种广泛存在于生物体的红色素，尽管“虾青素”一词在日常生活中不常使用，但虾青素存在于许多种人类食物之中。大多甲壳类动物如虾、龙虾、螃蟹等呈现的红色均因虾青素积累所致，一些鱼肉如鲑鱼的肉色也是虾青素积累的结果。在实际生产中，虾青素常用作鱼虾等水产养殖动物的饲料添加剂，以便弥补人类膳食中虾青素的缺乏，同时改善水产养殖产品的质量[1-2]。动物实验表明虾青素有抑制肿瘤发生[3]、增强免疫功能、延缓衰老[4]等多方面的生物学功能，因此在功能食品、饲料、化妆品和医药等方面有着广阔的应用前景[5]。

红发夫酵母所产虾青素是胞内色素，菌体的高密度生长使虾青素产量增加，通过营养物的流加分批培养能够达到高密度菌体培养的目的。在摇瓶培养基成分优化组合研究的基础上[6]，对红发夫酵母的5 L反应器进行了发酵规律的研究。

1 材料与方法

1.1 菌株

红发夫酵母菌株Phaffia rhodozyma由华南理工大学生化工程研究所驯化保存。

1.2 培养基

1.2.1 斜面培养基（g/L）

葡萄糖 20，酵母粉 3，蛋白胨 5，麦芽汁 3，琼脂20，pH5。

1.2.2 液体种子培养基（g/L）

葡萄糖20，酵母粉3，蛋白胨5，麦芽汁3，pH 5。

1.2.3 发酵培养基（g/L）

混合碳源（糖蜜40%、淀粉塘60%）30，混合氮源（玉米浆 40%、硫酸铵 60%）7，MgSO4·7H2O 1.5，（NH4）3C6H5O72，Na2HPO42.0，pH 5。

1.3 主要仪器与设备

高效液相色谱仪：美国安捷伦公司（型号：DG－2）；紫外分光光度计：澳大利亚GBC科仪公司（型号：CINTRA20）；电子分析天平：瑞士制造（型号：AG204）；生化培养箱：澳大利亚Thermoline（型号：WEST6100）；低温摇床：美国BRUNSWICK科学有限公司（型号：Innova4330）；超净工作台：苏净集团安泰公司；冷冻离心机：日本日立公司（型号：CF7D2）；pH计：美国Sartorius公司；电热鼓风恒温干燥箱：上海实验仪器厂；立式电热压力蒸汽消毒器：浙江绍兴医疗器械厂（型号：YXQ.L31.400）；手提式压力蒸汽消毒器：江阴滨江医疗设备厂（型号：YX－280）；发酵罐：德国BBrau公司生产的5 L反应器；光学显微镜：无锡照相器材厂（型号：L－1000）；恒温水浴锅：深圳天南地北实业有限公司。

1.4 培养方法

1.4.1 菌种保藏

1）菌株接入斜面培养基，20℃培养48 h，4℃保藏，每月传代1次；

2）20℃培养48 h，离心后加无菌新鲜培养基和甘油，甘油浓度10%～20%，-70℃～-80℃低温冷冻保藏。

1.4.2 种子培养

将一环菌苔（20℃培养3 d～4 d的斜面种）接种于250mL的锥形瓶，20℃、150r/min的恒温摇床培养48h。

1.4.3 摇瓶培养

250 mL锥形瓶中装30 mL培养基，灭菌后以8%（体积分数）的接种量接入培养48 h的种子液，20℃、150 r/min摇床培养。

1.4.4 生物反应器培养

反应器和培养基灭菌后以8%（体积分数）的接种量接入培养48 h的种子液，控制通气和搅拌，按照一定的方式补料，并定时取样测定数据。培养过程中维持温度为20℃，培养液pH为5.0。

1.5 测定方法

1.5.1 酵母生物量的测定

取10 mL培养液，3000 r/min离心10 min，倒掉上清液，用蒸馏水离心洗涤2次后再用蒸馏水将菌体移入预先干燥至恒重M0的称量瓶中，置于105℃电热恒温干燥箱中干燥至恒重，用精密电子天平称量称量瓶和菌体总重M，则生物量可用下式计算：

1.5.2 培养液中残糖的测定

采用菲林试剂快速滴定法测定总糖。

1.5.3 虾青素的提取[7]

取5 mL培养液，离心分离洗涤3次，加3 mL 3 mol/L HCl，沸水浴3 min，迅速冷却，离心分离洗涤2次，添加5 mL甲醇振荡提取1 min，离心取上清液。如果提取不完全，再加甲醇提取，直至菌体无色。提取液置冰箱冷藏至测定。

1.5.4 虾青素测定[8]

采用 HPLC 测定。流动相为 φ甲醇:φ乙腈=9:1，流动相流速为1.0 mL/min，柱温为30℃，PDA检测器在474 nm处进行虾青素分析。以Sigma公司的虾青素作为标准样。

2 结果与讨论

2.1 分批培养

将经活化培养48 h的种子液按8%（体积分数）接种量接入含3.5 L培养基的5 L反应器中，培养温度20℃，初期控制溶氧50%，后期由于耗氧增加，控制在40%。不补料也不控制pH，每12 h测定生物量、降糖曲线、pH变化曲线、虾青素含量和虾青素产量变化曲线。5 L反应器分批培养红发夫酵母生长曲线如图1所示。

图1 5 L反应器分批培养红发夫酵母生长曲线Fig.1 Growth curves of batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

从图1可知，0 h～12 h为延迟期，红发夫酵母生物量增加不明显，耗糖速率较慢；12 h～36 h为指数生长期，生物量增加明显，耗糖速率很快，12h生物量1.61g/L，而36 h的生物量10.46 g/L；36 h～84 h为减速期，生物量增加和耗糖速率减慢，60 h生物量16.91 g/L，残糖仅剩2.5 g/L；84 h～120 h为静止期，生物量和残糖变化不大，84 h生物量最高17.68 g/L，120 h生物量17.61 g/L。5 L反应器分批培养红发夫酵母虾青素变化曲线如图2所示。

图2 5 L反应器分批培养红发夫酵母虾青素变化曲线Fig.2 Astaxanthin curves of batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

从图2可知，在指数生长期内，虾青素合成速率较快。12 h虾青素含量仅为50 μg/g；此后平滑上升，36 h虾青素含量283 μg/g；36 h～48 h，虾青素大量合成，虾青素含量和产量突增，48 h虾青素含量591 μg/g，产量8.28 mg/L。此后，虾青素合成速率减慢，108 h虾青素含量最高768 μg/g，虾青素产量也最高13.54 mg/L。5 L反应器分批培养pH变化曲线如图3所示。

从图3可知，分批培养pH的变化过程。0 h～24 h pH 下降，24 h pH4.44；24 h～36 h 上升，36 h pH6.74；48 h pH下降后，逐渐回升至6.50左右，并基本维持在这个水平。这说明在培养初期随着糖分的消耗，产生较多的酸性物质，导致pH值下降，糖分消耗完后，碱性物质增多，pH再度上升。

图3 5 L反应器分批培养pH值变化曲线Fig.3 pH curve of batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

2.2 pH-stat控制流加培养

pH-stat控制流加培养是补料分批培养的一种，即通过流加控制pH基本恒定在最佳值。补料分批培养是一种介于分批培养和连续培养之间的操作方式，在进行分批培养的时候，向反应器加入培养基的一种或多种成分，以达到延长生产期和控制培养过程的目的。

2.2.1 酸碱流加培养

将经活化培养48 h的种子液按8%（体积分数）接种量接入含3.5 L培养基的5 L反应器中，培养温度20℃，初期控制溶氧50%，后期由于耗氧增加，控制在40%。pH用浓氨水和10%的硫酸控制在5.0左右，每12 h测定生物量、降糖曲线、pH变化曲线、虾青素含量和虾青素产量变化曲线。5 L反应器pH-stat流加培养红发夫酵母生长曲线如图4所示。

图4 5 L反应器pH-stat流加培养红发夫酵母生长曲线Fig.4 Growth curves of pH-stat fed-batch culture of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

从图4可知，酸碱流加培养很好的控制pH在5.00左右，因此酵母细胞生长比没有控制pH值的分批培养要好。12 h细胞生物量4.68 g/L；24 h～48 h为指数生长期，耗糖速率较快；48 h生物量16.97 g/L，高于同期分批培养生物量，提高了21.13%；此后减速，84 h到108 h为静止期，84 h生物量最高18.65 g/L，相对于分批培养生物量最高值提高了5.5%。5 L反应器pH-stat流加培养红发夫酵母虾青素变化曲线如图5所示。

图5 5 L反应器pH-stat流加培养红发夫酵母虾青素变化曲线Fig.5 Astaxanthin curves of pH-stat fed-batch of P.rhodozyma in 5 L bioreactor

从图5可知，在指数生长期内，虾青素合成速率较快，相对于分批培养上升比较平稳。12 h虾青素含量仅为140 μg/g；此后逐渐上升，36 h虾青素含量285 μg/g；36 h～48 h，虾青素大量合成，虾青素含量和产量突增，48 h虾青素含量535 μg/g，产量9.05 mg/L；此后，虾青素积累继续增加，96 h虾青素含量最高851 μg/g，虾青素产量也最高15.82 mg/L，相对于分批培养要早12 h，也提高了10.8%和16.8%。

2.2.2 混合碳源-氨水流加培养

将经活化培养48 h的种子液按8%（体积分数）接种量接入含3.5 L培养基的5 L反应器中，培养温度20℃，初期控制溶氧50%，后期由于耗氧增加，控制在40%。以混合碳源（糖蜜和淀粉糖）代替硫酸，用氨水代替氢氧化钠来响应发酵pH变化的一种偶联补料培养模式，10%氨水控制pH在5.00，当pH超过5.00时，由反应器系统自动泵启动流加碳源，从而达到流加碳源和氮源的目的。每12 h测定生物量、降糖曲线、pH变化曲线、虾青素含量和虾青素产量变化曲线。5 L反应器pH-stat混合碳源流加培养红发夫酵母生长曲线如图6所示。

从图6可知，由于24 h到36 h，培养液pH值上升很快，超过5.00，反应器系统自动流加混合碳源，残糖从24 h14.8 g/L增加到36 h的22.1 g/L，此后基本控制pH在5.00左右，12 h细胞生物量2.9 g/L，由于流加了混合碳源，延长了细胞生长期；从24 h～96 h生物量一直在显著增长，96 h生物量27.51 g/L，高于同期酸碱流加培养生物量，提高了47.8%；此后减速，96 h到120 h为平稳期，120 h生物量最高28.12 g/L，相对于酸碱流加培养生物量最高值提高了50.7%。5 L反应器pH-stat混合碳源流加培养红发夫酵母虾青素变化曲线如图7所示。

图6 5 L反应器pH-stat混合碳源流加培养红发夫酵母生长曲线Fig.6 Growth curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by pH-stat feeding with mixture carbon sources

图7 5 L反应器pH-stat混合碳源流加培养红发夫酵母虾青素变化曲线Fig.7 Astaxanthin curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by pH-stat feeding with mixture carbon sources

从图7可知，在指数生长期中前期，虾青素合成速率较快，相对于酸碱流加培养上升更明显。12 h虾青素含量仅为162 μg/g，此后虾青素大量合成，虾青素含量和产量突增，36 h虾青素含量531 μg/g，到72 h虾青素含量最高802 μg/g，相对于酸碱流加培养虾青素含量最高值下降了，这是由于生物量大大增加引起的。96 h虾青素产量达到最高19.94 mg/L，相对于酸碱流加培养虾青素产量最高值提高了26%。

2.2.3 混合碳源-尿素流加培养

将经活化培养48 h的种子液按8%（体积分数）接种量接入含3.5 L培养基的5 L反应器中，培养温度20℃，初期控制溶氧50%，后期由于耗氧增加，控制在40%。以混合碳源（糖蜜和淀粉糖）代替硫酸，以尿素代替氨水来响应发酵pH变化的一种偶联补料培养模式，其中尿素和硫酸铵以4:1混合，相当于10 g/L的硫酸铵，当pH超过5.00时，由反应器系统自动泵启动流加碳源，从而达到流加碳源和氮源的目的。每8小时测定生物量、降糖曲线、虾青素含量和虾青素产量变化曲线。5 L反应器流加混合碳源-尿素培养红发夫酵母生长曲线如图8所示。

图8 5 L反应器流加混合碳源-尿素培养红发夫酵母生长曲线Fig.8 Growth curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by feeding carbamide and mixture carbon sources

由图8可知，在对数生长期细胞生长较快，比生长速率为3.70×10-2h-1。在64 h开始流加尿素后，细胞生长减缓。培养到144 h，生物量达到30.81 g/L。由图8还可以看到，继续培养生物量开始下降，说明细胞开始老化死亡。

本次试验共流加约298 g糖分；初始培养液体积为3.5 L，糖浓度为35.22 g/L，含糖量为123.3 g；最终培养液体积4.5 L，残糖浓度9.52 g/L，含糖量为42.8 g，故整个培养过程中实际耗糖量为378.5 g；生物量最终达到30.20 g/L，共计135.9 g，故糖分转化为酵母细胞的转化率为0.359。5 L反应器流加混合碳源-尿素培养红发夫酵母虾青素变化曲线如图9所示。

图9 5 L反应器流加混合碳源-尿素培养红发夫酵母虾青素变化曲线Fig.9 Astaxanthin curves of P.rhodozyma in 5 L bioreactor by feeding carbamide and mixture carbon sources

由图9可知，在136 h前，虾青素产量呈持续增长状态，并于136 h达到最大产量28 mg/L。136 h以后继续培养，发现虾青素产量和含量同步迅速下降，估计是酵母细胞进入衰亡期的原因。虾青素含量在对数期增长较快，在加入尿素后，虾青素含量稳步增大，并于136 h 达到最大值 923 μg/g。

3 结论

pH-stat控制流加培养相对于不控制pH-stat的分批培养，红发夫酵母的生物量、虾青素含量和产量都有显著提高。但是，不同方式进行pH-stat控制流加培养的结果也有差异，以混合碳源（糖蜜和淀粉糖）代替硫酸，用氨水代替氢氧化钠来响应发酵pH变化的偶联补料培养模式，不仅能维持最适pH值，同时也流加了混合碳源，延长了细胞生长期，但各项指标最高值出现的时间并没有推迟，相对于酸碱流加培养生物量最高值提高了50.7%，虾青素产量最高值提高了26%。以混合碳源（糖蜜和淀粉糖）代替硫酸，以尿素代替氨水来响应发酵pH变化的偶联补料培养模式，能同时达到流加碳源和氮源的目的，生物量、虾青素产量及含量均达到了较高水平，但是流加尿素虾青素合成积累较慢，培养时间过长，影响其实际生产操作的可行性。因此，以混合碳源代替硫酸，用氨水代替氢氧化钠来响应发酵pH变化的偶联补料培养模式是比较理想的方式。

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Study on Astaxanthin Production of Phaffia rhodozyma in pH-stat Fed-batch Cultures

ZHU Xiao-li1,LIANG Shi-zhong2,DENG Mao-cheng1,ZHU Ming-jun2
（1.Department of Food and Biology Engineering，Guangdong Industry Technical College，Guangzhou 510300，Guangdong，China；2 College of Bioscience and Bioengineering，South China University of Technology，Guangzhou 510640，Guangdong，China）

The growth and astaxanthin production of Phaffia rhodozyma in pH-stat fed-batch cultures with different feeding methods and grown at specific growth rates similar to the batch culture was compared.The results described that fed-batch culture was better than the batch culture.The different feeding methods included acid-alkali,compound carbon sources and ammonia,compound carbon sources and urea fed-batch culture.To the end of achieving and the cost efficiency of astaxanthin production,compound carbon sources and ammonia fed-batch culture was the best method,the highest astaxanthin production was 19.94 mg/L at 96 h culture time.

Phaffia rhodozyma;astaxanthin;pH-stat;fed-batch culture

广东省科技攻关项目（2002C1040101）；广州市科技计划项目（2003Z2-E0131）

朱晓立（1980—），男（汉），工程师，讲师，硕士，研究方向：食品生物技术。

2010-08-27