董 浩，段小波，单晓枫，胡桂学

（1.吉林农业大学生命科学学院，吉林 长春130118；2.吉林农业大学动物科学技术学院，吉林 长春130118）

小鹅瘟即鹅细小病毒病（goose parvovirus，GPV），是雏鹅和雏番鸭的一种急性或亚急性败血性传染病，主要侵害3～20日龄雏鹅和雏番鸭，以出血性、纤维素性渗出性肠炎为主要特征。该病传染快，发病率和死亡率高，是严重危害养鹅业的重要传染病之一。现已证明，GPV基因组为单链、线性DNA，大小约为5.0kb，完整的病毒粒子呈六面体，无囊膜，含正链DNA和负链DNA的病毒粒子数目基本相等，两种极性链很容易发生退火。其基因组含有两个主要开放性阅读框（ORF），右侧ORF（RORF）编码3种结构蛋白（VP），即 VP1、VP2、VP3，它们位于同一读码框，共用一个终止密码子；左侧ORF（LORF）编码非结构蛋白（NS）。其中，VP3为主要结构蛋白，是病毒衣壳的主要成分，约占总蛋白量的80%，且暴露于病毒粒子表面，是病毒刺激集体产生保护性抗体的抗原蛋白［1］。

霍尔多巴吉白鹅具有个体大、体质健壮、抗病力强等特点，产绒率高、羽绒品质好，与当地普通白鹅相比具有明显的优势。近几年，吉林省多个地区的鹅业公司从匈牙利引进霍尔多巴吉白鹅种蛋进行孵化，扩充商品鹅资源。本试验采用的小鹅瘟GPV－H株是从吉林省某鹅厂病死的霍尔多巴吉雏鹅体内分离得到的［2］，本试验主要通过对VP3基因的克隆和序列分析，了解本次发病的霍尔多巴吉雏鹅体内的小鹅瘟病毒的来源，为了解小鹅瘟的传播途径和防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验菌株、毒株 大肠杆菌DH5α购于TaKa－Ra［宝生物工程（大连）有限公司］；小鹅瘟病毒GPV－H是从吉林地区某鹅厂病死的霍尔多巴吉雏鹅体内分离到。

1.2 引物 根据鹅细小病毒基因序列（GenBank登录号为GPU25749）设计并合成了1对引物P1/P2，扩增全长GPV VP3基因片段1.6kb，由大连TaKaRa公司合成。斜体部分为酶切位点。

1.3 主要试剂 琼脂糖购于格特兰试剂公司；TaKaRa质粒小提试剂盒、TaKaRa胶回收试剂盒、限制性内切酶BamHⅠ、HindⅢ，T4连接酶；ExTaq酶，dNTP混合液，ExTag Buffer等购于TaKaRa［宝生物工程（大连）有限公司］。

1.4 小鹅瘟病毒核酸的提取 取GPV－H毒株鹅胚尿囊液500μL，经90℃水浴处理10min后，加入蛋白酶K（50μg/mL）和终浓度为1%SDS，56℃水浴40min，用等体积的酚/氯仿，氯仿依次抽提后，用乙醇沉淀核酸，70%乙醇漂洗，静置风干后用TE缓冲液悬浮，－20℃保存备用。

1.5 VP3基因的扩增 以1.4提取的核酸为模板，以P1、P2为引物，扩增GPV－H目的基因。PCR反应体系如下：10×ExTaqBuffer，2.5μL；P1（20 pmol/μL），0.5μL；P2 （20pmol/μL），0.5μL；dNTP，2μL；模板DNA，2.5μL；四馏水，16.5μL；ExTaqTMDNA聚合酶，0.5μL。

PCR反应条件为：95℃预变性5min，94℃变性1min、54℃退火1min、72℃延伸2min，共30个循环；最后72℃彻底延伸10min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分析。

1.6 VP3的PCR产物的克隆 按照TaKaRa公司胶回收试剂盒说明书进行操作，回收纯化1.5产物目的片段，回收产物与pMD 18－T－simple载体相连接。连接体系为：Ligation solution I 5μL，pMD 18－T－simple 1μL，回收产物2μL，去离子水2μL，共10μL，混匀，16℃2h。

1.7 连接产物的转化 取1.6中连接产物5μL转入200μL大肠杆菌DH5α的感受态细胞中，冰浴放置30min，42℃热激90s，再置冰浴中2min，加入100μL LB液体培养基，37℃，200r/min振摇1h后，按常规方法涂布于含有Amp（25μg/mL）的LB固体培养基平板上。37℃培养12～16h。

1.8 重组子的筛选与鉴定 挑取1.7平板上白色菌落若干个，接种至5mL含25μg/mL Amp的LB液体培养基中，37℃，200r/min培养过夜。按照质粒提取试剂盒操作步骤，对得到的菌液进行质粒提取。用BamHⅠ单酶切以及BamHⅠ和HindⅢ双酶切进行鉴定。1%琼脂糖凝胶电泳检测酶切结果。

1.9 重组质粒的测序与分析 将质粒酶切鉴定为阳性的菌液送往宝生物工程（大连）有限公司进行序列测定，采用DNAMAN软件进行序列分析。参考序列见表1。

表1 参考毒株

2 结果

2.1 PCR扩增结果 根据VP3基因组序列设计的特异性引物，以小鹅瘟基因组DNA作模板，扩增出长度约为1 600bp的条带（图1）。

图1 VP3基因扩增结果

2.2 重组质粒的筛选和酶切鉴定结果 用BamHⅠ和HindⅢ限制性内切酶对转化子的质粒进行酶切鉴定，通过电泳，在1 600bp和2 700bp处得到两条特异性条带，见图2。

图2 重组质粒酶切鉴定结果1～3：转化子质粒；4：λ－HindⅢdigest DNA Marker

2.3 GPV－H VP3基因序列分析结果 GPV－H株VP3基因测序结果显示：基因全长为1 605bp，编码534个氨基酸。与参考毒株的基因序列进行比较，结果发现，核苷酸同源性在92.5%～98.9%之间。通过DNAMAN软件作出基因进化树，分析表明，GPV－H株与波兰和匈牙利分离到的5株病毒亲缘关系较近（图3）。

图3 14株小鹅瘟病毒VP3基因进化树分析

3 讨论

本试验克隆了鹅细小病毒GPV－H株的VP3基因，其序列与GenBank中发表的13株鹅细小病毒具有高度的同源性，达到了92.5%～98.9%，表明鹅细小病毒的VP3基因是高度保守的。这也表明用一种疫苗，可以防治大部分国内外野毒株的感染［3］。

本次试验的发病鹅源为霍尔多巴吉白鹅，此种鹅原产地为匈牙利，近几年，在吉林省常以种蛋形式被引进孵育，从基因进化树结果表明，本试验所分离到的GPV－H株与匈牙利、波兰等欧洲地区报道的小鹅瘟基因序列亲缘关系最近，极有可能是以种蛋带毒方式，被引进到本省。

［1］ 贺云霞，王君伟，王立群，等.鹅细小病毒H1株VP2基因的克隆和序列分析［J］.中国预防兽医学报，2003，25（5）：330－333.

［2］ 董浩，马磊，单晓枫，等.霍尔多巴吉白鹅小鹅瘟病毒的分离与鉴定［J］.中国兽医杂志，2010，46（10）：49－50.

［3］ Karsten Hueffer.The natural host range shift and subsequent evolution of canine parvovirus resulted from virus－specific binding to the canine transfer in receptor［J］.Journal of Virology，2003，2：1718－1726.