杨丽萍，高淑霞，张秀玲，孙海涛，姜文学

(山东省农业科学院畜牧兽医研究所山东省畜禽疫病防治与繁育重点实验室，济南 250100)

地克珠利(Diclazuril)是20世纪80年代由比利时杨森制药公司开发研制的非聚醚类化学合成抗球虫药，属三嗪类化合物，具有高效、低毒、广谱的特点，能有效地降低养禽业因球虫感染带来的经济损失［1］，在养兔业中也广泛用于球虫病的防治。

食品添加剂联合专家委员会(JECFA)和欧盟药品管理局(European Medicines Agency)分别对地克珠利的毒理学研究数据进行了评估，并推荐了日允许摄入量(Acceptable Daily Intakes)和最高残留限量(MRLs)，农业部第235号公告也对地克珠利的 MRLs作出规定［2-7］。已有研究多以 HPLC法［1］、毛细管电泳法［8］或 LC-MS/MS［9］法测定了家禽组织中地克珠利的残留，但目前尚缺乏家兔血浆或组织中地克珠利检测方法相关的文献报道。

对家兔血浆中地克珠利的HPLC检测技术的研究试验，建立了快速、稳定的家兔血浆中地克珠利的提取方法，为进一步研究地克珠利在家兔组织中的残留及其规律提供了技术支持。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 液相系统:岛津高效液相色谱仪，SPD-10A检测器，CTO-10A柱温箱，LC-10AD泵，DGU-4A脱气装置，N-2000双通道色谱工作站;XH-C旋涡混合器(江苏金坛医疗仪器厂);TGL-16G高速台式离心机(上海安亭科学仪器厂);BP211D电子天平(德国赛多利斯股份有限公司);LD5-2A离心机(北京医用离心机厂);L-128氮吹浓缩仪(北京来亨科贸有限公司技术开发中心)。

1.2 试剂 甲醇、乙腈为色谱纯，三乙胺、乙酸、乙酸乙酯、N，N二甲基甲酰胺(DMF)为分析纯。对照品地克珠利购自中国兽医药品监察所，批号:H0130805，含量为99.7%。妥曲珠利由湖北省武穴市龙翔药业有限公司生产，批号:090103，含量为98.5%。

2 对照溶液的配制

精密称取地克珠利10.03 mg，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇超声溶解后，定容，摇匀，配成浓度为200 μg/mL的地克珠利对照溶液I。取对照溶液I用甲醇逐级稀释为 180、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.562、0.781 μg/mL 的对照溶液。精密称取妥曲珠利10.11 mg，置于50 mL容量瓶中，加入甲醇溶解后，定容，摇匀，配成浓度为199 μg/mL的妥曲珠利对照溶液II。取对照溶液II用甲醇稀释为99.5 μg/mL的内标对照溶液。

3 色谱条件

色谱柱为依利特色谱柱(Hypersil ODS 2.5 μm，250 mm ×4.6mm);C18 保护柱规格为4.0 mm×10 mm(江苏汉邦科技有限公司);流动相为乙腈∶水∶三乙胺∶冰乙酸 =55 ∶45 ∶0.2 ∶0.12(V/V);流速为1.0 mL/min;柱温为室温;紫外检测波长为240 nm;进样量为 20 μL。

4 提取方法

取空白血浆0.18 mL，加入地克珠利对照溶液0.02 mL，加入 99.5 μg/mL 的妥曲珠利 0.02 mL，混匀后加入DMF 0.1 mL，涡旋提取30 s，加入乙腈0.2 mL，涡旋提取 30 s，样品 12 000 r/min 离心 10 min，取上清液进样20 μL分析。

5 方法学考察

5.1 系统适应性试验 取空白血浆0.2 mL，除不加地克珠利及妥曲珠利外，按照4所述方法提取，所得空白色谱图和配制样品色谱图见图1。理论塔板数按地克珠利计算不低于3 000，地克珠利及妥曲珠利与相邻色谱峰的分离度均大于2.0，拖尾因子分别为 1.01、1.05，出峰时间分别为 7.9 min 和11.1 min。

图1 典型HPLC色谱图

5.2 线性关系与检测限 取空白血浆0.18 mL，加入 1.562、3.125、6.25、12.5、25、50、100、200 μg/mL地克珠利对照品溶液0.02 mL，使得血浆中地克珠利的浓度为 0.156、0.312、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 μg/mL，加入 99.5 μg/mL 的妥曲珠利0.02 mL，按照4所述方法提取，取上清液进样20 μL分析。以地克珠利与妥曲珠利峰面积的比值为纵坐标、血浆中地克珠利的浓度为横坐标进行回归处理，地克珠利在0.156 ～20.0 μg/mL 浓度范围内，呈现良好的线性关系。回归方程为Y=0.183 2x+0.001 0，r=0.999 2。在信噪比 S/N=3 的条件下，血浆中地克珠利的检测限为0.078 μg/mL。

5.3 回收率与精密度试验 取空白血浆0.18 mL，加入0.02 mL不同浓度的对照溶液，配制成0.312、5.00、18.00 μg/mL 高、中、低 3 个浓度的对照血浆，按照4所述方法提取，平行操作5份，以血浆标准曲线测得量与地克珠利加入量的比值计算方法回收率。分别于当日和连续3天测定，计算日内和日间精密度，结果见表1。

表1 地克珠利回收率与精密度测定(n=5)

6 讨论

6.1 提取方法的选择 比较了乙酸乙酯萃取、甲醇或乙腈沉淀蛋白、乙腈联合DMF沉淀蛋白3种提取方法，采用乙酸乙酯液-液萃取法提取血浆中的地克珠利与沉淀蛋白沉淀法相比，杂质较多，血浆中内源性物质影响地克珠利与妥曲珠利的测定，且回收率低;采用甲醇或乙腈沉淀蛋白法对地克珠利与妥曲珠利的检测无影响，但提取效率不及乙腈联合DMF沉淀蛋白法的提取效率高。因地克珠利易溶于DMF中，先用DMF提取，为进一步沉淀蛋白，再加入乙腈，使得离心后的样品不必滤膜过滤，可以直接进样。

6.2 色谱柱的选择 比较了不同厂家的色谱柱，考察了 Diamonsil C18(2.5 μm，250 mm ×4.6 mm)和 Hypersil ODS(2.5 μm，250 mm × 4.6 mm)色谱柱。结果地克珠利在各柱上的分析时间接近，但保留行为却差异很大，Hypersil ODS色谱柱能够对样品实现良好的分离。

6.3 流动相的选择 考察了乙腈∶水(50∶50)和甲醇∶水(70∶30)系统，发现乙腈:水对样品中组分能实现良好的分离，但地克珠利与妥曲珠利峰脱尾，故采用冰乙酸及三乙胺调整溶液pH值改善峰形。当流动相为乙腈∶水∶三乙胺∶冰乙酸=55∶45∶0.2 ∶0.12(V/V)时，地克珠利及妥曲珠利分离度很好，峰形也很好。

6.4 小结 试验建立了以妥曲珠利为内标，HPLC法测定家兔血浆中地克珠利含量，该方法具有简单快速、灵敏的特点，在一定浓度范围内，线性关系良好，回收率高，无干扰。

［1］施祖灏，朱良强，卢运站，等.鸡组织中地克珠利和妥曲珠利残留 HPLC检测方法的建立［J］.中国兽医学报，2009，29(1):79-81.

［2］EMEA.Veterinary Medicines Evaluation Unit:Diclazuril(Extension to All Rum Inants and Porcine Species)，Summary Report(1，2)［R］.1996，2004.

［3］EMEA.Veterinary Medicines Evaluation Unit:Toltrazuril，Summary Report(1)［R］.1998，1999，2000，2004.

［4］JECFA.Toxicological Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food:Dielazuril，WHO Food Additives Series 36［R］.Geneva，1996.

［5］JECFA.Toxicological Evaluation of Certain Veterinary Drug Residues in Food Dielazuril，WHO Food Additives Series 41［R］.Geneva，1998.

［6］中华人民共和国农业部公告第235号.动物性食品中兽药最高残留限量［S］.

［7］中国兽药典委员会.中华人民共和国兽药典(二○○五年版)［S］.

［8］施祖灏，陆俊贤，葛庆联，等.高效毛细管电泳法同时检测地克珠利和妥曲珠利的含量［J］.中国兽药杂志，2008，42(9):13-16.

［9］张 涛，张丽芳，江善祥，等.液相色谱一串联质谱法测定鸡蛋中地克珠利的残留量［J］.安徽农业科学，2009，37(14):6314-6316.