杜鹤，崔丽娜，姚辉，宋经元，张辉*

（1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193）

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基于COI条形码序列的珍珠母及其混伪品的DNA分子鉴定△

杜鹤1，崔丽娜1，姚辉2，宋经元2，张辉1*

（1.长春中医药大学，吉林 长春 130117；2.中国医学科学院药用植物研究所，北京 100193）

目的：探讨应用COI条形码序列对珍珠母及其混伪品进行物种鉴定的可行性。方法：用MEGA 4.0等软件计算珍珠母及其混伪品种内及种间变异，构建珍珠母及其混伪品的NJ树。结果：珍珠母种内COI序列变异小，种间存在较多的变异位点，种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离。通过构建的系统聚类树图可以看出，珍珠母不同来源个体均聚在一起，能够与其混伪品区分开。结论：基于COI序列的DNA条形码技术可以很好的鉴定珍珠母的正品来源及其混伪品。

珍珠母；DNA条形码；COI；鉴定

珍珠母Margaritifera concha为我国常用中药材，具有平肝潜阳，安神定惊，明目退翳的功效。用于头痛眩晕，惊悸失眠，目赤翳障，视物昏花[1]。据《中国药典》2010年版记载，珍珠母为蚌科动物三角帆蚌Hyriopsis cumingii（Lea）、褶纹冠蚌Cristaria plicata（Leach）或珍珠贝科动物马氏珍珠贝Pteria martensii（Dunker）的贝壳。去肉，洗净，干燥。现市场以其混伪品和同属做珍珠母药用的情况较为普遍，如蚬科动物河蚬Corbicula fluminea（Muller）、蚌科动物背瘤丽蚌Lamprotula leai（Gray）等[2]。由于珍珠母正品与其混伪品的形态学特征差别很细微，用传统的方法很难鉴定，所以为保正药材的质量及其临床疗效，需要更快速、准确地方法鉴定珍珠母的正品来源与其混伪品。

DNA条形码技术是近来发展起来的物种鉴定新方法，通过对基因组中一段短的、标准的DNA片段进行分析从而对物种进行准确鉴定[3-4]，成为生物分类和鉴定的研究热点和方向[5-8]。本研究是应用DNA条形码技术，对珍珠母及其混伪品的DNA条形码COI序列进行比对分析，构建分子系统树，进而对珍珠母及其混伪品进行鉴别。

1 材料与方法

1.1 材料

褶纹冠蚌Cristaria plicata（Leach）药材购自安徽亳州药材市场，标本号AS13MT01、AS13MT02。两种混伪品COI序列来自于GenBank，珍珠母及其混伪品信息见表1。

表1 材料来源

1.2 方法

1.2.1 DNA提取 取新鲜材料，去壳后用已灭菌的手术剪把样品剪成小块，取30 mg样品，用液氮研碎肌肉组织[9]，再用 DNA提取研磨仪（Retsch MM400，Germany）研磨 2 min（30次·min－1）后，使用动物DNA提取试剂盒（北京天根生化公司）提取总DNA。

1.2.2 PCR扩增及测序 扩增引物COI序列通用引物：正向为 LCOI490 5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′，反向为 HCO2198 5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′[10]。PCR反应体积为 25μL，体系内含 MgCl22μL（25 mmol·L－1）、dNTP 2μL（2.5 mmol·L－1）、PCR buffer2.5μL（10×）、引物各1.0μL（2.5μmol·L－1）（北京生工生物技术公司合成）、聚合酶0.2μL（Biocolor BioScience＆Technology Co.，China）、双蒸水13.3μL、总 DNA约1μL（～30 ng）。PCR反应条件为：94℃，1min；94℃，1 min，45℃，1.5 min，72 ℃，1.5 min，5cycles；94 ℃，1 min，50℃，1.5 min，72℃，1 min，35cycles；72℃，5 min。PCR扩增产物经纯化后，使用ABI 3730XL测序仪（Applied Biosystems Co.，USA）双向测序。

1.2.3 数据处理 测序峰图利用CodonCode Aligner V 2.06拼接并校正，去除引物区，获得长度为658bp的样品序列。对于从GenBank获得的COI序列，采用CodonCode Aligner V 2.06软件，与拼接好的样品序列比对后，去除与样品序列相对应的658 bp以外的区段，保留长度≥550 bp的网上序列。最后将序列用软件MEGA 4.0比对并进行遗传距离等分析，并构建NJ系统聚类树，同时利用bootstrap（1 000次重复）检验各分支的支持率。

2 结果与分析

2.1 种内序列变异

样品AS13MT01与AS13MT02序列长度为658 bp，含3个PolyT和1个PolyG结构，GC含量为39.6%。12个种内序列，比对后序列长度为658 bp，有15个碱基变异位点，详见表2。种内平均K2P距离为0.005 4，种内最大K2P距离为0.011 5。

表2 褶纹冠蚌种内碱基变异情况表

2.2 种间序列变异

褶纹冠蚌与其主要混伪品COI序列间存在较多的变异位点（见图1），种间平均K2P距离为0.356 3，最小K2P距离为0.193 4。

图1 珍珠母及其混伪品序列间的变异位点

2.3 珍珠母及其混伪品NJ树

基于COI序列，通过邻接法（NJ）所构建的系统聚类树图（图2）可以看出，珍珠母不同来源个体均聚在一起，支持率为100，同时也很容易与其余混伪品区别开来。因此COI条形码序列适用于药材珍珠母与其混伪品的鉴定。

图2 基于COI序列构建的珍珠母及其混伪品的邻接（NJ）树

3 讨论

珍珠母种内COI序列有15个变异位点，种内平均K2P变异为0.005 4，种内最大K2P变异为0.011 5。说明珍珠母种内COI序列变异很小比较稳定。珍珠母及其混伪品COI序列种间K2P距离的平均值为0.356 3，最小 K2P距离为0.193 4。存在较多的变异位点，种间的遗传距离显著大于种内的遗传距离。同时，从基于COI序列构建的珍珠母及其混伪品NJ树可以看出，珍珠母不同来源个体均聚在一起，支持率较高，与其它混伪品能够很明显区分开。因此，基于COI序列的DNA条形码技术可以很好的鉴定珍珠母及其混伪品，为该药材的准确鉴定提供了新的方法。

[1]国家药典委员会.中国药典[S].一部.北京：中国医药科技出版社，2010：216.

[2]来复根，冯迈高.中药珍珠母及其混伪品的鉴别[J].中药材，1985，5：22-25.

[3]Schindel DE，Miller SE.DNA barcoding，a useful tool for taxonomists[J].Nature，2005，435：17.

[4]陈士林，宋经元，姚辉，等.药用植物DNA条形码鉴定策略及关键技术分析[J].中国天然药物，2009，7（5）：322-327.

[5]陈士林，姚辉，宋经元，等.基于 DNAbarcoding（条形码）技术的中药材鉴定[J].世界科学技术—中医药现代化，2007，9（3）：7-12.

[6]Hebert PD，Ratnasingham S，deWaard JR.Barcoding animal life：cytochrome c oxidase subunit1 divergences among closely related species[J].Proc Biol Sci，2003，270（S1）：S96-S99.[7]Hebert PD，Cywinska A，Ball SL，et al.Biological identifications through DNA barcodes[J].Proc Biol Sci，2003，270（1512）：313-321.

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[9]徐巧情，刘俊.三角帆蚌不同组织基因组DNA提取效果比较[J].水生态学杂志，2010，3（2）：121-124.

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Molecular Identification of Margaritifera concha and its Adulterants Using COIBarcode Sequence

DU He1，CUILi-na1，YAO Hui2，SONG Jing-yuan2，ZHANG Hui1
（1.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun130117，China；2.Institute of Medicinal Plant Development，Chinese Academy of Medical Sciences，Peking Union Medical College，Beijing100193，China）

Objective：This study explores the feasibility of using the COIbarcode sequence in identification of the Margaritifera concha and its adulterants.Methods：Intra-and inter-specific genetic distances ofMargaritifera concha and its adulterants have been analyzed by MEGA 4.0 software using COI sequences and the NJ tree has been constructed.Results：Margaritifera concha exhibited low intra-specific sequence variation and the inter-specific sequence have high variation between Margaritifera concha and its adulterants.The inter-specific genetic distanceswere obviously higher than the intra-specific ones.The sample of Margaritifera concha clustered together and can separated from its adulterants in the dendrogram constructed.Conclusion：As a DNA barcode，COI sequence can identify the Margaritifera concha with its adulterants.

Margaritifera concha；DNA barcoding；COI；identification

吉林省财政厅项目——药用动物DNA条形码鉴定技术研究

*张辉，E-mail：zhanghui＿8080＠163.com

2011-10-08）