北京四环科宝制药有限公司（100070） 曹相林 陈婧 魏墨玺

二甲双胍格列吡嗪片为治疗糖尿病的复方制剂，包括格列吡嗪和盐酸二甲双胍两种药物成分，两种药物成分的抗糖尿病作用机制相互补充，提高了对血糖的控制。其有关物质成分的测定方法在USP31[1]中有收载，本研究采用USP31中有关物质的测定方法检测二甲双胍格列吡嗪片时，发现杂质峰的分离度达不到要求，不能对杂质有效检出。因此本研究通过大量试验建立了一种能够有效检测复方制剂二甲双胍格列吡嗪片有关物质的高效液相色谱法，并申请了专利。

1 仪器与试药

Agilent 1100高效液相色谱仪（美国Agilent公司）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）；CP225D型电子天平（德国赛多利斯公司）；4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺对照品（批号：100282-200001）、双氰胺对照品（批号：100206-200302）、盐酸二甲双胍对照品（批号：100664-200602）、格列吡嗪对照品（批号：100281-200602）均购自中国药品生物制品鉴定所；乙腈为色谱纯，水为纯化水，其余试剂均为分析纯。

2 HPLC测定方法的建立与验证

2.1 色谱条件的建立 参考中国药典2010年版[2]中关于盐酸二甲双胍和格列吡嗪的有关物质色谱条件，初步确定采用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，在同一色谱条件下检查二甲双胍格列吡嗪片的有关物质。进行了如下筛选：①磷酸二氢铵溶液（称取1.15g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水至1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05）-乙腈（80：20）为流动相。检测波长225nm。柱温：30℃。②将①项下流动相的比例调整为85：15。③以磷酸二氢铵溶液（0.575g磷酸二氢铵和4.32g辛烷磺酸钠，加水1000ml，用三乙胺调节pH值至7.0±0.05）-乙腈（83：17）为流动相。检测波长225nm。柱温：30℃。④将③项下流动相的比例调整为84：16。结果发现④的色谱条件使各杂质峰的分离度达到要求。

2.2 检测波长的确定 分别取两种主药及其特殊杂质适量，加流动相配制成适宜浓度的溶液。分别于200～400nm波长范围内扫描，四种物质均在225nm附近有最大吸收，并且格列吡嗪和4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺在275nm均有较强吸收。结合破坏试验的结果，为减小盐酸二甲双胍对格列吡嗪和4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺测定的干扰，最终确定盐酸二甲双胍有关物质测定的检测波长为225nm，格列吡嗪有关物质的检测波长为275nm。

2.3 最小检测限的确定 通过试验确立了双氰胺和4-(2-(5-甲基吡嗪-2-甲酰氨基)乙基)-苯磺酰胺的最小检测限分别为0.1ng和0.5ng。灵敏度符合要求。

2.4 辅料干扰试验 经试验验证选用本研究中的HPLC测定方法，空白辅料不干扰样品的杂质检测。

2.5 破坏试验 取格列吡嗪原料、二甲双胍格列吡嗪片、盐酸二甲双胍与空白辅料、盐酸二甲双胍原料、格列吡嗪与空白辅料分别进行酸、碱、氧化、高温及光照等试验。试验结果表明，在本研究建立的色谱条件下，主峰与有关杂质及降解物的杂质峰能够完全分离，说明此色谱条件可以完全满足样品有关物质的测定。

2.6 样品测定 按本研究中建立的HPLC测定方法和USP31分别对同一批二甲双胍格列吡嗪片进行了检测。对样品中盐酸二甲双胍有关物质中已知杂质双氰胺和未知杂质的单杂和总杂的检测结果表明，新建立的HPLC测定方法均比USP31的方法检测灵敏度高。对样品中格列吡嗪有关物质的测定结果表明，新建立的HPLC测定方法能够使已知杂质苯磺酰胺有效检出，分离度达到要求；而在USP31方法的色谱条件下，已知杂质苯磺酰胺和格列吡嗪出峰时间非常接近，两者基本重合为一个峰，不能使苯磺酰胺有效检出。结果见附表。

附表 二甲双胍格列吡嗪片有关物质测定结果

3 讨论

本研究通过进行流动相的筛选、检测波长的确定、最小检测限的确定、辅料干扰试验、破坏试验及与美国药典方法的对比检测实验等相关研究，重新建立了二甲双胍格列吡嗪片的有关物质测定方法，该方法快速准确，重现性好，可用于二甲双胍格列吡嗪片的质量控制。