王晓艳，张新日

(1.山西医科大学，太原 030001;2.山西医科大学第一医院呼吸科，太原 030001)

乌司他丁对机械通气致肺损伤大鼠肺组织CC16表达的影响

王晓艳1，张新日2

(1.山西医科大学，太原 030001;2.山西医科大学第一医院呼吸科，太原 030001)

目的 通过观察乌司他丁(UTI)对大潮气量机械通气大鼠肺组织Clara细胞分泌蛋白(CC16)表达的影响，探讨CC16在机械通气所致肺损伤(VILI)发病中作用以及UTI对VILI的干预作用。方法 24只雄性Wistar大鼠随机分为对照组、大潮气量组和UTI干预组，观察其肺组织病理学改变，测定肺组织中丙二醛(MDA)和BALF中总蛋白(TP)含量，采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测肺组织CC16 mRNA的表达，采用免疫组织化学染色法检测肺组织中CC16蛋白表达及Clara细胞计数。结果 与对照组比较，大潮气量肺组织MDA的含量及BALF总蛋白含量明显升高(P＜0.01)，而肺细支气管上皮细胞CC16mRNA及其蛋白表达水平明显降低(P＜0.01);与大潮气量组比较，UTI干预组大鼠肺组织中MDA的含量及BALF总蛋白含量明显降低(P＜0.01)，而肺细支气管上皮细胞CC16mRNA及其蛋白表达水平明显升高(P＜0.01)。结论 大潮气量机械通气导致肺组织CC16 mRNA及其蛋白表达水平降低在VILI发病中起重要作用，乌司他丁不但能促进Clara细胞分泌CC16而抑制肺组织炎症反应，还能抑制脂质过氧化物的产生，对VILI有一定保护作用。

机械通气;急性肺损伤;CC16;乌司他丁

大量研究表明，多种炎症介质和细胞因子参与了机械通气所致肺损伤(VILI)的发病过程，其机制仍不十分清楚。近年来研究发现，Clara细胞分泌蛋白——CC16具有抗炎、抗氧化、抗纤维化等多种生物活性，但其是否参与VILI的发病过程目前尚未见到文献报道。乌司他丁(UTI)是一种广谱蛋白酶抑制剂，能抑制炎症介质和氧自由基的产生和释放，在临床上主要用于DIC、休克和急性胰腺炎等疾病的治疗，但有关UTI对VILI时炎性介质和细胞因子影响的研究报道甚少。本文拟通过动物实验观察大潮气量机械通气大鼠肺组织CC16的表达水平，以及UTI对其表达的影响，探讨UTI对VILI的干预作用。

1 材料和方法

1.1 动物分组及模型制备

取成年雄性 Wister大鼠24只(山西医科大学实验动物中心提供，清洁级 合格证号：SCXK2009-0001)，体重300～380 g，随机分为3组：①对照组：未行机械通气;②大潮气量组：VT30 mL/kg，通气前3 d开始每天上午及通气后1小时经腹腔注入生理盐水3 mL;③乌司他丁(广东天普生化医药股份有限公司产品)组：VT30 mL/kg，通气前3 d开始每天上午及通气后1 h经腹腔注入UTI 3 mL(10万U/kg)。

25%乌拉坦4 mL/kg腹腔注射麻醉大鼠后行气管切开。除对照组外，其余各组大鼠均通过三通管与动物人工呼吸机(DH-150型，浙江大学医学仪器厂制造)相连接行机械通气。各组大鼠的通气参数除潮气量外，其余参数均相同，即 RR：60次/min，I/E：1/3，FiO2：21% 。通气时间为 120 min。

1.2 BALF及肺组织标本采集与处理

通气结束后经腹主动脉放血处死大鼠，暴露气管及肺脏，结扎右主支气管，用生理盐水反复灌洗左肺(4 mL×3次)，灌洗液(BALF)回收率达75%以上。将收集到的 BALF离心(3 000 r/min，10 min，r=10 cm)后。取上清液 -20℃冻存待检。取部分右肺组织，用10%的甲醛固定，常规石蜡包埋、行HE染色和免疫组织化学染色。另取部分新鲜肺组织，-70℃保存，用于提取肺组织总RNA以及测定肺组织MDA含量。

1.3 肺组织MDA含量测定

采用硫代巴比妥酸比色法测定大鼠肺组织中丙二醛(MDA)含量。测定方法及操作步骤按试剂盒说明进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.4 BALF中总蛋白含量测定

采用考马斯亮蓝染色法测定BALF中总蛋白含量，操作步骤按试剂盒说明进行，试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.5 肺组织CC16免疫组织化学染色及Clara细胞计数

采用链霉素亲和-生物素-过氧化酶复合物(SABC)法测定大鼠肺组织CC16蛋白表达，具体操作步骤参照试剂盒说明(试剂盒购自北京博奥森生物有限公司)进行。兔抗大鼠抗体工作浓度为1：50，以磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作阴性对照。

结果判断：阳性染色为细胞胞浆呈棕黄色，染色阳性细胞即为Clara细胞。在400倍光镜下对每张组织切片随机选取5个视野进行观察。采用BI-2000医学图像分析系统检测每个视野的光密度值，以上述5个视野的平均值作为该大鼠肺组织CC16蛋白表达的相对含量。在高倍镜下(×400)对每张组织切片随机选择4个终末或呼吸性细支气管，计算Clara细胞占细支气管上皮细胞总数的百分比。

1.6 肺组织CC16mRNA测定

肺组织CC16mRNA水平的检测依照一步法RT-PCR试剂盒(上海生工生物工程技术服务有限公司)操作指南，以提取的大鼠肺组织总RNA作为模板，上游引物：5′-tgaagaggctggtggatacc-3′，下游引物：5′-ttggtgtagggaggtcaagg-3′。反应条件为：反转录50℃，30min，灭活 反转录 酶 94℃，2min，预 变性94℃，30s，54℃ 退火、延伸 72℃，4 min，共 32 个循环。内参照为磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)，上游引物：5′-tgaacgggaagctcactgg-3′，下 游 引 物： 5′-tccaccaccctgttgctgta-3′。扩增产物在 2%琼脂糖凝胶(0.5μg/mL溴化乙锭)中进行电泳，片段分别为185 bp和307 bp，用Bio-Rad凝胶数字成像系统进行扫描分析，mRNA相对含量由CC16与GAPDH吸光度值×面积的比值表示。

1.7 统计学方法

全部数据用SPSS13.0软件包进行统计分析，数据以¯x±s表示，组间差异比较采用方差分析法，各组均数间两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

表1 各组肺组织MDA含量及BALF中总蛋白含量(¯x±s)Tab.1The levels of MDA in the lung and total protein in BALF groups(¯x±s)

2 结果

2.1 大鼠肺组织HE染色结果

HE染色高倍镜下观察，对照组肺泡结构和各级支气管上皮完整，肺泡间隔正常，无明显炎症细胞浸润。大潮气量组可见弥漫性肺间质水肿和大量炎症细胞浸润，部分肺泡破裂融合，肺泡腔内有少量出血，UTI组可见肺间质水肿和少量炎性细胞浸润，肺泡腔结构基本完整，肺损伤程度较大潮气量组明显减轻(图1～3见封二)。

图7 各组CC16、GAPDH mRNA电泳图M：marker;A：UTI pretreatment group;B：High tidal volume ventilation group;C：Control groupFig.7 Electrophoresis figure of CC16mRNA and GAPDH mRNA in groups

2.2 肺组织MDA含量和BALF总蛋白含量测定

各组大鼠肺组织MDA和BALF总蛋白含量测定结果见表1。结果显示：大潮气量组大鼠肺组织MDA含量和BALF总蛋白含量明显高于对照组和UTI干预组(均 P＜0.01);UTI干预组大鼠肺组织MDA含量和BALF总蛋白含量虽高于对照组，但较大潮气量组明显降低(均P＜0.01)。

2.3 肺组织CC16mRNA及其蛋白表达及Clara细胞百分比测定

各组大鼠肺组织CC16mRNA及其蛋白及Clara细胞百分比测定结果见表2和图4～7(图4～6见封二)。结果显示：大潮气量组大鼠肺组织CC16mRNA及其蛋白表达及Clara细胞百分比明显低于对照组和 UTI干预组(均 P＜0.01);UTI干预组大鼠肺组织CC16mRNA及其蛋白表达及Clara细胞百分比虽低于对照组，但较大潮气量组明显增高(均 P＜0.01)。

3 讨论

呼吸机所致肺生物伤或炎症性损伤是机械通气的严重并发症，也是当今医学界研究的热点和难题。近年来研究发现，Clara细胞分泌蛋白——CC16具有抗炎、抗氧化、抗纤维化、免疫调节及抑制肿瘤生长、转移等多种生物学活性，但其是否参与VILI的发病过程目前尚未见到文献报道。

Clara细胞是排列在肺细支气管黏膜上的一种非纤毛上皮细胞，具有分泌功能。1881年，Kolliker首先发现了这类细胞。1937年Max Clara描述了这类细胞的形态特征，同时以他的名字命名。Clara细胞分泌的主要物质之一是Clara细胞分泌蛋白(CCSP)，因其相对分子量为 15840，故称为 CC16。近年来随着对 CC16研究的不断深入，人们发现CC16不但具有抗炎、抗氧化、调节免疫等多种生物功能，而且与急性肺损伤的发生、发展有密切关系，是肺组织特异性表达的一种内源性抗炎因子。

表2 各组肺组织CC16mRNA及其蛋白及Clara细胞百分比(¯x±s)Tab.1The expression of CC16 and protein in lung and the percentage of Clara cells in groups(¯x±s)

目前认为CC16是急性肺损伤的一个新的生物标志物［1］。急性肺损伤时细胞内 NF-кB常发生活化，NF-кB活化后可上调多种细胞因子，如 TGF-β1、TNF、IL-8等的表达，但对 CC16基因转录却具有抑制作用，导致Clara细胞中CC16含量减少［2］。CC16减少后削弱了对 PLA2的抑制作用［3］，使花生四烯酸类促炎细胞因子生成增多，导致炎症细胞大量聚集活化，分泌大量炎症介质而引起肺组织损伤。实验研究发现［4］，CC16缺陷大鼠在感染病毒或接受抗原刺激时比野生鼠表现出更强的炎症反应，而给予重组人 CC16后其炎症反应可明显减轻，说明CC16在抗炎作用中扮演着重要角色。本研究结果显示，大潮气量组大鼠肺组织可见弥漫性肺间质水肿和炎症细胞浸润，BALF总蛋白含量明显高于对照组，而肺组织CC16mRNA及其蛋白表达水平明显低于对照组，提示大潮气量机械通气所引起的急性肺损伤与CC16表达减少有一定关系。因此，通过上调CC16的表达可抑制肺组织炎症细胞发生活化，减少炎症介质的释放，对VILI应具有保护作用。

乌司他丁是一种广谱酶抑制剂，能稳定溶酶体膜，抑制溶酶体酶释放，清除氧自由基及抑制炎症介质的释放，近年来广泛用于ALI/ARDS的治疗，收到一定效果。谭朝华等［5］通过对油酸致急性肺损伤动物模型研究发现，乌司他丁对脂质过氧化物的产生具有明显抑制作用。Okumura等［6］研究发现，UTI不但能抑制脂质过氧化物的产生，还能抑制PMN在肺组织内聚集活化。Abe等［7］研究发现，UTI可通过上调抗炎因子(IL-10)的表达和清除肺组织内氧自由基而发挥抗损伤作用。本研究结果显示，UTI干预组大鼠肺组织CC16mRNA及其蛋白表达水平明显高于大潮气量组，而肺组织 MDA含量和BALF总蛋白含量较大潮气量组明显减少，同时肺组织充血、出血、渗出和炎症细胞浸润等病理损伤改变亦明显减轻，说明UTI对VILI具有一定防治作用。其机制包括两方面：①通过上调CC16的表达而抑制炎症细胞在肺内聚集、活化和释放炎症介质;②通过抑制脂质过氧化反应而减少肺内氧自由基的产生。

综上所述，肺组织Clara细胞数量及CC16含量减少与VILI发生、发展有密切关系。UTI一方面可通过促进CC16的合成而抑制肺组织炎症反应，另一方面又可通过抑制氧自由基的释放而减轻肺组织氧化性损伤，因而对 VILI的临床防治具有积极作用。

［1］ McAuley DM，Belfast UK，Michael A，et al.Clara cell protein CC16 a new lung epithelial biomarker for acute lung injury［J］.CHEST，2009，135(6)：1408-1410.

［2］ 罗佛全，傅华群.急性肺损伤大鼠肺组织CC16的表达及其对肺局部炎症反应的调控［J］.现代免疫学，2005，25(6)：502-506.

［3］ Yoshikawa S，Miyahara T，ReynoldsSD，etal. Clara cell secretory protein and phospholipase A2activity modulate acute ventilatol-induced lung iniury in mice［J］.J Appl physiol，2005，98(4)：1264-1271.

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［5］ 谭朝华，徐军美，杨东林，等.乌司他丁对兔急性肺损伤保护的实验研究［J］.中国医学工程，2005，13(2)：181-184.

［6］ Okumura Y，Inoue H，Fujiyama Y，et al.Effects of serine protease inhibitors on accumulation of polymorphonuclear leukocytes in the lung induced by acute pancreatitis in rats［J］.J Gastroenterol，1995，30：379.

［7］ Abe H，Kumagi K，Matsuda T，et al.Effect of ulinastatin on the free radical during cardio pulmonary bypass［J］.Masui，1995，44(7)：1005-1008.

Effects of Ulinastatin on the Expression of Clara cell Secretory Protein(CC16)in the Rat Lung in High Tidal Volume Mechanical Ventilation

WANG Xiao-yan1，ZHANG Xin-ri2
(1.Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China;2.Department of Respiratory Medicine，First Affiliated Hospital of Shanxi Medical University，Taiyuan 030001，China)

Objective To explore the role of ulinastatin(UTI)in the treatment course of ventilator-induced lung injury(VILI)by investigating the effect of UTI on expression of Clara cell secretory protein(CC16)in the lung of rats in high tidal volume mechanical ventilation.Methods Twenty-four male Wistar rats were randomly divided into three groups：control group，high tidal volume ventilation group and UTI pretreatment group.The levels of MDA in the lung and total protein in bronchoalveolar lavage fluid(BALF)were measured.The expression of CC16 mRNA in the lung was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR).The number of Clara cells and synthesis of CC16 were detected by immunohistochemistry.Results Comparing with the control group，the levels of MDA in lung and total proteinin bronchoalveolar lavage fluid were very significantly increased(P＜0.01)in the high tidal volume ventilation group，and the expression of CC16 was significantly decreased(P ＜ 0.01).Comparing with the high tidal volumeventilation group，the levels of MDA in the lung and total protein in bronchoalveolar lavage fluid were significantly decreased(P ＜0.01)in the UTI-pretreatment group，and the expression of CC16 mRNA and protein increased significantly.Conclusions CC16 plays an important role in ventilator-induced lung injury(VILI).The expression of CC16 mRNA and protein are reduced in a VILI rat model.Ulinastatin may effectively prevent the inflammatory process and ventilator-induced lung injury by increasing the level of CC16 and inhibit the lipid peroxidation.

Mechanical ventilation;Acute lung injury;CC16;Ulinastatin;Rat

R33

A

1671-7856(2011)04-0024-04

2010-11-12

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.004.006

山西省科技攻关项目，2007032016-1;太原市科技项目计划任务书，0801041)。

王晓艳(1985-)，女，硕士，主要研究方向：机械通气与肺损伤。Email：wxiaoxiao85@163.com。

张新日，硕士生导师，Email：ykdzxr61@yahoo.com.cn。