丛 喆，蒋 虹，金 光，陈 霆，王 卫，陶 真，姚 南，熊 竞，吴芳新，陈志伟，魏 强

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021;2.香港大学李嘉诚医学院艾滋病研究所，香港 999077)

SHIV1157ipd3N4中国恒河猴细胞适应株静脉感染中国恒河猴有效浓度的确定

丛 喆1，蒋 虹1，金 光1，陈 霆1，王 卫1，陶 真1，姚 南1，熊 竞1，吴芳新1，陈志伟2，魏 强1

(1.中国医学科学院医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021;2.香港大学李嘉诚医学院艾滋病研究所，香港 999077)

目的 确定SHIV1157ipd3N4静脉途径感染中国恒河猴的有效病毒浓度，明确SHIV1157ipd3N4感染实验猴体内病毒复制和免疫损伤情况。方法 10只正常中国恒河猴分成6组，分别用10倍系列稀释的病毒液1 mL静脉感染，测定血浆病毒载量，CD4+/CD8+，CD4+T淋巴细胞绝对数，分析感染后恒河猴体内病毒复制和免疫损伤情况。结果 5TCID50/mL以上浓度的SHIV1157ipd3N4能通过静脉途径感染中国恒河猴。结论 该实验的成功进行为SHIV/中国恒河猴疾病及评价模型的建立奠定了良好的基础，为今后使用此模型评价抗病毒药物或疫苗提供了条件。

SHIV1157ipd3N4;中国恒河猴;模型，动物;AIDS

R.M.Ruprecht以SHIVKB9为骨架构建了表达HIV-1 C亚型 env的 SHIV-1157i，并经静脉途径感染印度恒河猴得到 SHIV1157ipd3N4［1，2］。它所具有高度复制能力的、CCR5受体嗜性、经黏膜传播这些特性，使它在研究HIV感染和发病机制及评价AIDS候选疫苗的功效方面具有重要的现实意义。SHIV1157ipd3N4能通过静脉途径成功感染印度恒河猴，黏膜途径感染印度恒河猴、猪尾猴和中国恒河猴［3-4］，但其静脉感染中国恒河猴的有效浓度、疾病进程及所引发的病毒免疫指标有哪些变化，与黏膜途径感染引起的变化又是否相同呢?本研究旨在明确SHIV1157ipd3N4在中国恒河猴体内感染的有效浓度及在病毒学和免疫学等方面的变化，为今后此模型在我国的应用奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物

中国恒河猴10只，购自北京协尔鑫生物资源研究所［SCXK(京)2005-2005］，用商品化膨化饲料饲养，体重3～5 kg。经间接免疫荧光法(IFA)检测排除相关慢病毒(SIV、SRV-1，2，5、STLV-1)感染。

1.2 病毒

感染毒株为SHIV1157ipd3N4，本实验室扩增制备，批号为 20090706。中国恒河猴 PBMCs滴定TCID50滴度为 5×102TCID50/mL。

1.3 分组设计及感染方法

10只恒河猴随机分为6个剂量组，由10-1至10-6，分别经后肢静脉感染稀释好的病毒液1 mL。G1005V、G1006V、G1007V (10-1，50TCID50)，G1008V、G1009V 、G1010V(10-2，5TCID50)，G1011V、G1012V、G1013V(10-3，0.5TCID50)，G1014V(10-4，0.05TCID50)。

1.4 样品采集和指标测定

在感染前和感染后 7、14、21、28、42、56、70 及84 d采集EDTA抗凝血4 mL，分别测定血常规、血浆病毒载量、CD4+/CD8+、CD4+细胞绝对数和血浆结合抗体水平。

1.5 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴外周血病毒载量的检测

TRIzol法提取血浆中病毒 RNA，Quantitect SYBR Green RT-PCR Kit(Qiagen，204243)测定血浆病毒 RNA 载量［5］。

1.6 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴CD4+T细胞绝对数检测

测定外周血中 CD4+/CD8+比值，根据血常规结果，计算出CD4+T细胞绝对数［6］。

1.7 SHIV1157ipd3N4感染恒河猴外周血总结合抗体滴度检测

恒河猴血浆样品灭活后系列稀释，用“人类免疫缺陷病毒抗体诊断试剂盒(酶联免疫法)”(生物梅里埃，A4 4284018-86)检测交叉性体液免疫反应，高于Cut-off值的最大血浆稀释度定义为SHIV特异性总结合抗体滴度［7］。

图1 10倍系列稀释SHIV1157ipd3N4静脉感染中国恒河猴外周血病毒载量结果Fig.1 The viremia(viral RNA copies/mL plasma)in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

2 结果

2.1 SHIV1157ipd3N4静脉感染恒河猴外周血病毒载量结果

50 TCID50感染猴中G1005V和G1007V均在感染后7 d就检出血浆病毒载量，G1006V也在14 d阳转。5 TCID50感染猴 G1008V、G1009V、G1010V 的血浆病毒载量则均出现在感染后14 d。

6只感染猴高峰期的载量都在105～107copies/mL之间，42 d后载量水平均有所下降，但随后反弹。0.5 TCID50和 0.05 TCID50感染猴 G1011V、G1012V、G1013V、G1014V在实验期间未出现血浆病毒载量。

2.2 SHIV1157ipd3N4静脉感染恒河猴CD4+/CD8+比值结果

50 TCID50感染猴 G1005V、G1006V、G1007V 在感染后21 d均有下降，随后反弹。5 TCID50感染猴中除G1010V外，G1008V和G1010V也在21 d下降并反弹。G1009V则不降反升，但它在56 d有一次大幅下降，但也仍然在 1以上。0.5TCID50和0.05TCID50感 染 猴 G1011V、G1012V、G1013V、G1014V在实验期间基本保持恒定(图2)。

2.3 SHIV1157ipd3N4静脉感染恒河猴CD4+细胞绝对数结果

各剂量组之间在CD4+T细胞绝对数上变化基本相同。感染猴中除了50 TCID50感染猴 G1007V和5 TCID50感染猴 G1008V在实验后期有升高外，其它4只在整个实验期间基本保持水平。未感染的4只实验猴则整体呈现逐渐上升的趋势(图3)。

2.4 SHIV1157ipd3N4静脉感染恒河猴外周血总结合抗体滴度测定

50 TCID50感染猴G1005V和G1007V的抗体在感染后21 d就出现了，另一只感染猴G1006V也在28 d阳转。与此同时，5 TCID50感染猴中只有G1009V在21 d抗体阳性，其它两只感染猴G1008V和G1010V抗体阳转时间为42 d。42 d以后，6只感染猴之间的抗体水平逐渐接近了。0.5 TCID50和0.05 TCID50感 染 猴 G1011V、G1012V、G1013V、G1014V在实验期间未检出抗体(图4)。

图2 10倍系列稀释SHIV1157ipd3N4静脉感染中国恒河猴外周血CD4+/CD8+T淋巴细胞比值Fig.2 The changes of CD4+/CD8+ratio of T lymphocytes in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

图3 10倍系列稀释SHIV1157ipd3N4静脉感染中国恒河猴外周血CD4+T淋巴细胞绝对数Fig.3 The CD4+T cell counts(per l blood)in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

图4 10倍系列稀释SHIV1157ipd3N4静脉感染中国恒河猴外周血总结合抗体滴度Fig.4 The titers of Ab in the Chinese-origin rhesus macaques infected intravenously with 10-fold dilution of SHIV1157ipd3N4

3 讨论

SHIV1157ipd3N4。具有高度复制能力、CCR5受体嗜性和经黏膜传播的特性，使它在研究HIV感染和发病机制及评价AIDS候选疫苗的功效方面具有重要的现实意义。

本实验室利用中国恒河猴PBMCs制备了一批SHIV1157ipd3N4的细胞适应株，本研究旨在明确该批次SHIV1157ipd3N4细胞适应株静脉途径感染中国恒河猴的有效浓度及在病毒学和免疫学等方面的变化，为今后此模型在我国的应用奠定基础。

本次研究中，我们使用中国恒河猴PBMCs对病毒的毒力进行了滴定。根据滴定的结果，使用4个10倍系列稀释的病毒剂量感染中国恒河猴，通过其血浆病毒载量、CD4+/CD8+比值及CD4+细胞绝对数的测定，来确定该病毒感染中国恒河猴的感染剂量范围及感染情况。由于动物数量有限，为了明确剂量效应关系，我们采取了10倍系列稀释病毒的策略，拉大了各组之间的病毒剂量范围。并且对可能感染的实验组，各使用了3只实验猴，理论上不能被感染的10-4稀释度，只用了一只实验猴。结果证明，我们这样安排是可行的。10-1到 10-2的感染猴，即 50 TCID50到 5 TCID50SHIV1157ipd3N4感染的实验猴均成功建立了系统性感染，而10-3和10-4的感染猴则没有被感染。根据病毒滴定的结果，1 mL 10-3和10-4稀释度的病毒液中只含有 0.5 TCID50和0.05 TCID50的病毒，理论上不可能感染动物，因此目前这个结果和病毒滴定的结果是相符合的，从另一个侧面也证明了病毒滴定的准确性。

与SHIVSF162p3静脉感染猴结果略有不同，各不同剂量组阳性猴的病毒、免疫等各项指标没有显示出很明显的量效关系，除高剂量组(50 TCID50)的血浆病毒载量出现得比低剂量组(5 TCID50)略早几天外，载量的峰值及持续时间都没有依照病毒浓度的高低，有相应的变化。各组感染猴高峰期的载量都在105～107copies/mL之间，CD4+/CD8+的变化也基本相同。与未感染猴不同的是，绝大多数感染猴在感染高峰期还是有一个CD4+/CD8+的下降，虽然过程很短暂，与此同时，各组之间外周血CD4+T细胞的绝对数的变化趋势相同，均没有明显的下降。这点也符合之前的报道，对于 CCR5-SHIV来说，CD4+T细胞的减少主要发生在外周免疫器官，如肠道的派氏淋巴结等，而在外周血中这种变化不明显。

本研究中，我们还注意了静脉感染早期外周血中总结合抗体滴度的变化和攻毒剂量之间的关系。结果表明，高剂量组(50 TCID50)的抗体出现得比低剂量组(5 TCID50)略早几天，且抗体水平增长得要快一些，但到了感染后期这种差距就消失了，基本都稳定在一个水平上了。这也说明，在感染早期，机体体液免疫的水平和消长与攻击病毒的剂量有一定的关系，一旦建立了系统性感染，这种区别就不存在了。

SHIV1157ipd3N4能通过静脉途径成功感染印度恒河猴，黏膜途径感染印度恒河猴、猪尾猴和中国恒河猴，但其静脉感染中国恒河猴的有效浓度、疾病进程及所引发的病毒免疫指标有哪些变化，与黏膜途径感染引起的变化又是否相同呢?本研究旨在明确SHIV1157ipd3N4在中国恒河猴体内感染的有效浓度及在病毒学和免疫学等方面的变化，为今后此模型在我国的应用奠定基础。

总之，通过本次静脉感染中国恒河猴研究，我们成功滴定了本批次 SHIV1157ipd3N4，掌握了SHIV1157ipd3N4在恒河猴体内的消长规律，今后可根据具体的实验目的选择合适剂量的SHIV1157ipd3N4建立静脉感染模型，进行 AIDS疫苗评价。

［1］ Song RJ，Chenine AL，Rasmussen RA，et al.Molecularly Cloned SHIV-1157ipd3N4： a highly replication competent，mucosally transmissible R5 simian-human immunodeficiency virus encoding HIV Clade C env［J］.J Virol，2006，80(17)：8729-8738.

［2］ Humbert M，Rasmussen RA，Song RJ，et al.SHIV-1157i and passaged progeny viruses encoding R5 HIV-1 clade C env cause AIDS in rhesus monkeys［J］.Retrovirology，2008，5： 94.Published online 2008 October 17.doi：10.1186/1742-4690-5-94.

［3］ Ho O，Larsen K，Polacino P，et al.Pathogenic infection of Macaca nemestrina with a CCR5-tropic subtype-C simian-human immunodeficiency virus［J］.Retrovirology，2009，6：65.

［4］ Chenine AL， SiddappaNB， KramerVG， etal.Relative transmissibility of an R5 clade C simian-human immunodeficiency virus across different mucosae in macaques parallels the relative risks of sexual HIV-1 transmission in humans via different routes［J］.J Infect Dis，2010，201(8)：1155-1163.

［5］ 丛喆，李兆忠，魏强，等.SYBR GreenⅠ实时荧光定量RTPCR测定猴免疫缺陷病毒(SIV)RNA拷贝数方法的建立［J］.中国实验动物学报，2006，14(4)：271-275.

［6］ 王卫，刘强，许琰，等.SHIV-KB9感染中国恒河猴有效浓度的确定［J］.中国比较医学杂志，2007，17(2)：67-71.

［7］ 张月娟，褚国方.ELISA检测HIV抗体室内质控血浆的使用与分析［J］.职业与健康，2007，23(4)：268-269.

Titration of a SHIV1157ipd3N4 Stock by Intravenous Inoculation of Chinese-Origin Rhesus Macaques

CONG Zhe1，JIANG Hong1，JIN Guang1，CHEN Ting1，WANG Wei1，TAO Zhen1，YAO Nan1，XIONG Jing1，WU Fang-xin1，CHEN Zhi-wei2，WEI Qiang1
(1.Key Laboratory of Human Disease Comparative Medicine，Ministry of Health;Institute of Medical Laboratory Animal Science，Chinese Academy of Medical Sciences;Key Laboratory of Human Disease Animal Models，State Administration of Traditional Chinese Medicine，Beijing 100021，China;2.AIDS Institute，Li Ka Shing Faculty of Medicine，The University of Hong Kong，Hong Kong 999077，China)

Objective To determine the viral concentration of SHIV1157ipd3N4 to infect Chinese-origin rhesus macaques intravenously，and to clarify the viral replication and immunological impairment in the monkeys after SHIV1157ipd3N4 inoculation.Methods 10 Chinese-origin rhesus macaques were used in this study.Firstly，all the monkeys were screened by serological test to ensure that they were free of SIV，SRV，and STLV.Then they were infected with 1 mL of 10-fold serial dilution of SHIV1157ipd3N4 separately.Finally to make blood routine examination and measure the viral loads of the monkeys by real-time RT-PCR.Results More than 5 TCID50/mL of SHIV1157ipd3N4 can infect the Chinese-origin rhesus macaques i.v.successfully.Conclusions Our findings of this study provide a firm basis for establishing a SHIV1157ipd3N4 infection model of Chinese rhesus macaques intravenously.This model would be very usefulfor HIV-1 subtype C vaccine and pathogenesis studies.

SHIV1157ipd3N4;Chinese-origin rhesus macaques;Animal model;AIDS

R33

A

1671-7856(2011)04-0012-04

2010-10-08

10.3969/j.issn.1671.7856.2011.04.003

国家十一五科技重大专项课题 (2009ZX10004-402，2008ZX10001-015-10)。

丛喆，硕士，副主任技师，从事实验动物病毒分子生物学和模型研究工作。

魏强，教授，博士导师，研究方向：实验动物病毒学。E-mail：weiqiang0430@sohu.com。