陈颖秋 马小星 黄永俊 邓泽丽

（西南大学，重庆 400715）

花色苷含量鉴定红葡萄酒真伪的研究

陈颖秋 马小星 黄永俊 邓泽丽

（西南大学，重庆 400715）

花色苷是葡萄酒中的一种红色素，主要存在于葡萄皮中，其骨架是苯并吡喃，通常与一分子葡萄糖结合成糖苷形式。酒龄较低的红酒中，呈色物质主要是花色苷，花色苷类物质的浓度与组成决定了葡萄酒颜色的深度，而颜色对于葡萄酒的感官质量起着重要作用。对于同一品种的葡萄酒，花色苷的含量在一定范围内有所增减，一般来说花色苷在新酿制的葡萄酒中含量为200～500mg/L。花色素可与酸性亚硫酸根离子结合成无色络合物的性质，在添加过量的酸性亚硫酸盐之后，酒的颜色会发生变化。这种变化是和花色苷的含量成正比例发展。100%葡萄汁酿造的葡萄酒通常在酸性条件下即pH值为4.0左右显红色；用碱滴定后，在pH值5.8～6.4范围内红色褪尽，酒液呈暗绿色或灰黑色；pH值8.9～10显示为黑色或深紫色。

红葡萄酒；花色苷；人工色素；褪色；pH值

红酒醇厚醉人，却难以鉴别真伪。同是一瓶芬芳的红色液体，可能是货真价实的加州红酒,也可能是添加了人工色素的红糖水。根据国际葡萄和葡萄酒组织（OIV，2006）的规定，葡萄酒是用新鲜的葡萄或葡萄汁经发酵酿成的酒精饮料。一般来说，市场上的葡萄酒可分为全汁和非全汁两大类，全汁葡萄酒是指用100%葡萄汁酿造而成的酒，以干红和干白为代表，是百分之百的纯葡萄酒。而非全汁葡萄酒是指用水、酒精、糖精、葡萄香精以及色素、酸、增稠剂、防腐剂等勾兑而成的“葡萄酒”。我国已经明令废止半汁葡萄酒的行业标准，半汁葡萄酒2007年5月起企业均停止生产；从去年7月1日起市场停止流通。按照《食品添加剂使用卫生标准》及《葡萄酿酒技术规范》的规定，葡萄酒中不允许添加甜蜜素、糖精钠、某些合成色素、增稠剂等食品添加剂。但是某些葡萄酒生产厂家为了降低生产成本，获取更多利益，通过添加合成色素、甜蜜素、糖精钠等减少葡萄汁的用量，损害消费者利益。某些葡萄酒中胭脂红、柠檬黄、亮蓝等人工合成色素严重超标。据了解，伪劣葡萄酒色素是从煤焦油中提取的，或以芳烃类化合物为原料合成的，通称煤焦色素或苯胺色素，对人体有害，危害包括一般毒性、致泻性、致突性（基因突变）与致癌作用。 因此，真伪葡萄酒的辨别对人体的身体健康具有十分重要的意义。目前各国科学家正在加紧研制红酒的 DNA鉴别技术，为与造假者较量增添新的有力武器。然而我国关于假葡萄酒的鉴定仍旧处于需求设备高、投入成本大、实验方法复杂的局面，可操作性对于一般的消费群体和小型企业来说并不强，而本实验从葡萄酒色素中花色苷的特殊性质与特征反应入手来鉴定其真伪，实验成本低、简单而易行，待技术成熟之后，此研究的实际意义和经济意义非常巨大，现提供两种方法以供参考。

（一）材料和方法

1.主要实验材料

市售张裕-麟球特级干红葡萄酒；纯山东蛇龙珠葡萄皮花色苷粉末；分析纯；氢氧化钠溶液；氯化氢溶液；胭脂红；柠檬黄；焦糖色素。

2.主要实验仪器

UltraScan PRO光谱光度计；pH S-3C型 酸度计；DJ型精密电子天平。

3.实验方法

（1）方法一：pH值显色法

在酸性溶液中，花色苷存在四种主要形式的平衡：蓝色醌式碱A，红色黄烊阳离子AH+，无色甲醇碱或甲醇假碱B，无色查尔酮C。在酸性很强的介质中(pH0.5)，红色的黄烊阳离子占主导地位。增加pH，黄烊阳离子浓度和颜色强度都会下降，这是由于红色黄烊阳离子被水的亲核攻击而水合，变成无色甲醇碱。甲醇碱失去A环和B环之间的共轭双键，因此不能吸收可见光。当黄烊阳离子随pH升高而失去质子时，蓝色醌式碱也增加。当pH继续升高，生成无色甲醇碱，通过开环再生成了查尔酮型。经过测定纯花色苷水溶液，柠檬黄，胭脂红，焦糖色素溶液在不同pH条件下的色度测值（预实验1）发现，花色苷水溶液在碱性环境中显黑绿色，添加一定量强酸（如HCL）后可回复本色；柠檬黄溶液在碱性环境中颜色变深，添加一定量强酸之后颜色变浅，但仍比原液深；胭脂红溶液在碱性环境中显紫红色，添加一定量强酸后可恢复本色；焦糖色素溶液在酸碱性条件下颜色变化均不明显。

①不同比例葡萄酒的配制

配制人工色素混合溶液，经过目测使之从感官上与葡萄酒颜色几乎无差异，再经色度仪的检测，确定人工配制色素混合溶液的用量为 0.5g/200ml的焦糖色素溶液 500ml、0.1g/ml的胭脂红色素溶液200ml、0.1g/ml的柠檬黄色素溶液100ml，并将其混合为800ml的人工色素液。用张裕特选级干红葡萄酒与之配制成为葡萄酒含量分别0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的混合溶液，分别取30ml于编号为 1至 11的烧瓶中；另外分别配制浓度为0.1mol/L和1.0 mol/L的氢氧化钠溶液和氯化氢溶液，记录室内温度。

②调节pH

在 pH S-3C型酸度计监测下，使用 1mol/L（粗调）和0.1mol/L（微调）的氢氧化钠溶液和氯化氢溶液，调节 1至11号溶液的pH值至2（然后重复①，重新配制不同比例的葡萄酒溶液，调节至4，如此重复，调节pH为6、8和10）

③色度值的测定

校正仪器后，选择透射模式为总透射，分别测量pH值为2、4、6、8、10时的不同比例葡萄酒溶液的L、a、b值。

（2）方法二：焦亚硫酸钠褪色法

有资料证明，因为花色素可与酸性亚硫酸根离子结合成无色络合物的性质，再添加过量的酸性亚硫酸盐之后，酒的颜色发生变化。在选取合适的亚硫酸盐时，经过对Na2SO3,NaHSO3,Na2S2O3,Na2S2O5等的分别褪色（预实验2），最终选取焦亚硫酸钠（Na2S2O5）作为本实验的漂白剂。这种白色或黄色结晶的亚硫酸盐，带着强烈的SO2气味，水溶液呈酸性，在食品加工中常作防腐剂、漂白剂、疏松剂。在研究花色苷与人工合成色素的差异性（预实验3）中，分别在花色苷标样和几种人工色素（柠檬黄、胭脂红等）中添加适量焦亚硫酸钠，进行充分的溶解。经目测可发现只有花色苷溶液有褪色现象，人工合成色素没有出现褪色现象；经过色度仪的检测，人工色素漂白前后光谱图，即反射率比透射率在不同波长下的曲线也基本重合，没有变化。根据以上预实验，决定利用焦亚硫酸钠能使花色苷退色而不能使人工色素退色的特异性来判断不同程度“假酒”的色度值特征。

①焦亚硫酸钠用量的确定

硫的二氧化物和它的类似物可引起花色素苷可逆脱色反应。花色素苷与亚硫酸根离子结合能行程一种物色结合物，可引起一些物质(如葡萄酒)颜色的减退。由于这种变化是可逆的，所以其结合物是不稳定的，等到亚硫酸根离子逐渐减少时，呈色作用逐渐加强，从而使无色变成有色。因为二氧化硫对花色苷的漂白是否可逆反应还有许多疑问。当二氧化硫量在 500～2000ug/g时，这种漂白是可逆的，在后续的加工中，通过大量水洗脱后，颜色可部分恢复。目前，多数学者对不可逆漂白的反应研究较多,认为二氧化硫在果汁的酸作用下形成亚硫酸氢根 ，它对花色苷4一位碳亲核攻击生成了无色的花色苷亚硫酸盐复合物。为了确定实验中添加的焦亚硫酸钠的量，又进行了一组探索实验（预实验4），向30ml（352mg/L即张裕麟球特级干红葡萄酒中花色苷的含量）花色苷溶液中，添加含量梯度增加的焦亚硫酸钠，进而从颜色和色度仪上观察得出，1g为合适的反应量。

②不同比例葡萄酒与焦亚硫酸钠的褪色反应

把葡萄酒用调配好的人工合成色素分别稀释，使之成为葡萄酒含量分别为0%、10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%的混合溶液，分别取 30ml于编号为1至 11的烧瓶中使分别测定其色度值；再将上述溶液分别加入1g焦亚硫酸钠，充分震荡溶解进行颜色的褪色漂白。

③色度值的测定

校正仪器后，选择透射模式为总透射，分别测量不同比例葡萄酒溶液与焦亚硫酸钠充分反应褪色后的L、a、b值。

（二）结果与讨论

1.不同比例葡萄汁的葡萄酒在不同pH条件下的色度值

不同比例葡萄汁的葡萄酒在不同pH条件下的色度值如下图（图 1～5）（通过检验离群值（t检验法），舍去离群值，再取平均值后所得）

图1

图2

图3

图4

图5

注：在L,a,b色空间中，L代表亮度（黑白度），从0到100逐渐变亮（变白）；A代表红绿，以0点为界，正值代表红色，负值代表绿色；b代表黄蓝，以0点为界，正值代表黄色，负值代表蓝色。△L为正值表示被测品比样品偏亮或偏白，为负值表示被测品比样品偏暗或偏黑。△A为正值表示被测品比样品偏红，为负值表示被测品比样品偏绿。△B为正值表示被测品比样品偏黄，为负值表示被测品比样品偏蓝。△E为综合色差值，和亮度差△L，红绿差△A，黄蓝差△B有关。

由图1、2可知，在pH=2，4时，不同比例葡萄酒的L，a，b三个值均未呈现规律性的变化趋势，因此说明在pH=2,4时，花色苷的无色结构拟盐基（AOH）和其紫色结构无水盐基（AO）之间存在一个随pH值变化的动态平衡，因pH值较小，花色苷的无色结构（AOH）占有较大比例，葡萄酒的颜色较浅，仍呈现出红色，原酒与假酒（比例为0%～90%的葡萄酒）未显现出明显的差异，因此不能判别真伪。由图 3、4、5可知，从100%葡萄酒至0%葡萄酒的L，a，b三个值呈现出规律性的上升趋势，其中又以pH=8，10时的a，b值上升趋势尤为明显，在pH=10时，不同比例葡萄汁的葡萄酒随花色苷含量的减小，L，a,b值呈现出最为明显的上升趋势（表1），且△E也呈现出最明显的上升趋势（图6）。当pH值较大时，花色苷的红色结构花色佯（A+ ）和其无色结构拟盐基（AOH）之间存在一动态平衡，花色苷的无色结构（AOH）占有较大比例。在碱性环境下，花色苷不稳定，变色导致红紫色减少甚至消失，显出灰绿色至墨绿色；而胭脂红色素和柠檬黄色素在碱性环境下较为稳定，几乎不变色，在酒样中依然呈现出原有的颜色，因此原酒与假酒（比例为0%～90%的葡萄酒）出现了明显的差异，能够辨别真伪。

表1 不同比例葡萄汁的葡萄酒在pH=10的条件下的色度值

图6 不同比例葡萄汁的葡萄酒在pH=10时△E变化趋势图

2.不同比例葡萄汁的葡萄酒在等量焦亚硫酸钠褪色作用下的漂白效果

表2 不同比例葡萄酒漂白前后的色度值比较

注：ΔE* (总色差) 是基于 L*、a*、b* 色差，并可以作为一个单独的指标来表示。在国家标准中，有总色差的计算公式：ΔE*＝（ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2）1／2，其中，ΔL*、Δa*、Δb*为前后两组数据的差值。△E*的趋势变化：在对稀释不同倍数的葡萄酒漂白前后色差的整理，可以得到△E*的趋势变化图（见图7）。

图7

随着葡萄酒稀释倍数的增加，葡萄汁含量的减少，色差值逐渐变小，即漂白前后的差异性变小。并且，从趋势图中可以明显发现数据间存在线性关系，这在一定程度上也显示了花色苷含量对漂白作用的单一影响性。但通过以上原理鉴别葡萄酒真伪存在一定的局限性。除了人工合成色素外，还有一些是利用葡萄皮天然色素和葡萄汁色素来达到葡萄酒的完美色泽。虽然国内厂家更多的使用廉价的人工合成色素，但是并不能排除其他天然色素的添加，而这部分并不能简单的根据焦亚硫酸钠的漂白退色方法来鉴别。此外，在实验进行过程中，焦糖色素的特别性也不能完全忽视，通过色度仪的测定，发现焦糖色素在添加焦亚硫酸钠前后的光谱图曲线有所不同，并不是完全不受外界条件的影响。在探索这个方面的原因时，发现这种色素非常特别，至今为止，科学技术尚不能确切的解释焦糖反应的机理，焦糖的结构组成也尚未被认识。并且根据不同的添加要求，这种色素的制备和生产也有不同，这在一定程度上，给我们探索带来了误差和不确定性。

（三）结论

1.在PH 值的影响下，单体花色素苷涉及到一种动态平衡而影响到酒的颜色：花色烊A（flavyliunion）红色分子结构与无色分子结构“拟盐基”AOH（pseudoase，2-苯基苯吡南）之间的动态平衡。pH 值越高，平衡向花色烊A 方向移动，故酒的颜色越深。未添加人工色素的葡萄酒通常在酸性条件下即 pH 值为 4.0 左右显红色; 用碱滴定后, 在 pH 值 5.8～6.4 范围内红色褪尽,酒液呈暗绿色或灰黑色; pH 值8.9-10显示为黑色或深紫色；反之在pH 值5.8～ 6.4范围内红色不褪尽, pH 值8.9～10，直接转为紫色或玫瑰红色的酒样，可判定该样品添加了人工合成色素。由方法一的结果和分析可知，调pH值不失为检验红葡萄酒真伪的一个简易、快速的方法，本探索实验将探索检验假酒最合适的pH范围初步定于8至10之间，有待更深入的研究与探索。

2.亚硫酸离子（SO3H-）与花色素苷接合存在另一种动态平衡。这个反应是可逆的，能够引起酒颜色的减退，而形成一种无色的结合物。方法二可以为葡萄酒真伪的辨别提供标准，测定葡萄酒的漂白前后的色度差时，不仅可以测得葡萄酒的真伪，甚至可以基本辨别葡萄酒加入人工合成色素的程度。

3.为验证本实验的可靠性与严谨性，另外选用了长城特级干红葡萄酒、王朝干红葡萄酒、通化精选干红葡萄酒进行相同对比实验，所得结果一致，充分说明了该实验方法的可靠性。

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TS262.6

A

1008-1151(2011)06-0094-03

2011-03-18

陈颖秋（1988－），女，广西钦州人，西南大学在读生，研究方向为食品加工；黄永俊（1987－），男，安徽芜湖人，西南大学在读生，研究方向为食品科学；马小星（1989－），女，山西襄垣人，西南大学在读生，研究方向为食品安全；邓泽丽（1989－），女，四川宜宾人，西南大学在读生，研究方向为食品安全与质量控制。