郭 霞,盛 磊,木合布力·阿布力孜,阿布力孜·阿布杜拉

1新疆医科大学新疆地方病分子生物学重点实验室;2新疆医科大学药学院药化有机教研室;3新疆医科大学基础医学院生物化学暨分子生物学教研室,乌鲁木齐 830011

新疆胀果甘草总黄酮的细胞毒活性研究

郭 霞1,盛 磊1,木合布力·阿布力孜2,阿布力孜·阿布杜拉3＊

1新疆医科大学新疆地方病分子生物学重点实验室;2新疆医科大学药学院药化有机教研室;3新疆医科大学基础医学院生物化学暨分子生物学教研室,乌鲁木齐 830011

为了探讨新疆胀果甘草总黄酮 (general flavonoids,GFs)对宫颈癌细胞的细胞毒活性,自制备胀果甘草GFs,通过离子阱喷雾式质谱技术分析,建立 GFs组分的指纹图谱;并且对 SiHa宫颈癌细胞进行 GFs药物干预,应用MTT法和流式细胞技术分别鉴定细胞活力和细胞凋亡率。获得了新疆胀果甘草 GFs组分的特征性指纹图谱,提取物中 GFs含量可达 35.40%;发现在 0～500μg/mL GFs浓度范围内,GFs药物干预引起细胞活力梯度性下降,其MTT法检出的最低值为 12%;在 0～1000μg/mL GFs浓度范围内,GFs诱导的细胞凋亡率呈现梯度性上升趋势,其流式细胞仪检出的最高值为 78%。结果表明新疆胀果甘草 GFs具有较强的细胞毒活性,能够抑制宫颈癌细胞生长与活力,并诱导细胞凋亡。

新疆胀果甘草;总黄酮;细胞毒活性

Abstract:To investigate the cytotoxic activity of general flavonoids(GFs)from XinjiangGlycyrrhiza inflataBat,on cervical carcinoma cells.GFswas prepared fromGlycyrrhiza inflata,and the finger printmap was characterized by Electro Spray Mass Spectrometry;SiHa cervical carcinoma cellswere treatedwith GFs,and the cell viability and cellular apoptosiswere deter mined byMTTmethod and flow cytometry,respectively.We discovered that GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflatahad special finger print characteristics;the content of flavonoids in the extractwas 35.40%;in the dose range of 0-500μg/mL GFs,the cell viability dropped gradually with the GFs treatment,and the lowest level by MTT detection was 12%;in the dose range of 0-1000μg/mL GFs,the ratio of cellular apoptosis induced by GFs increased gradually,and the highest level by flow cytometry detection was up to 78%.GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflatahad relatively high cytotoxic activity including the inhibition of cell growth and viability aswell as the induction of cellular apoptosis.In conclusion,thiswork may provide important evidence for further screening and isolation of active ingredients of flavonoids aswell as the development of new natural anti-cancer drugs.

Key words:XinjiangGlycyrrhiza inflata;general flavonoids(GFs);cytotoxic activity

甘草 (Glycyrrhizaroot,维语名为 Ququk buya,Bihsus)作为君药在维吾尔医药诸多复方制剂中占有一定比例,尤其是维吾尔医学用于调节四种异常体液的异常黑胆质成熟剂——复方木尼孜其颗粒[国药准字 Z65020166]含有可观比例的甘草成分[1]。甘草中的化学成分有三萜类、黄酮类、多糖类等,其中黄酮类成分可达 150余种,其中异甘草素、甘草素和甘草查耳酮 A有明显的抗氧化、抗炎和雌激素活性,在体外试验中能够抑制前列腺癌、乳腺癌和肝癌细胞生长[2]。有人推测,甘草黄酮类成分可能对雌激素依赖性肿瘤具有较强的抗癌活性。宫颈癌是妇科恶性肿瘤,但是甘草黄酮类化合物对宫颈癌细胞的细胞毒活性尚未见文献报道。

本研究从新疆胀果甘草中制备甘草总黄酮(general flavonoids,GFs),分析其质谱指纹图谱;通过 SiHa宫颈癌细胞的药物干预及细胞活力和细胞凋亡率鉴定,评价该药的抗宫颈癌细胞毒活性,为从新疆地区特色植物胀果甘草研发抗癌新药奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器和试药

主要使用的仪器有离子阱电喷雾式质谱仪(LCQ-ESI-MS,Ther mo Fishers公司),CO2孵育箱(Hera Cell-150,Ther mo公司),生物安全柜 (Thermo KS-18,Ther mo公司 ),酶标仪 (Beckmann Coulter公司)和流式细胞仪 (LSR II,BD公司)。SiHa细胞由中国科学院上海分院细胞库提供。RPM I1640培养基、胎牛血清 (FBS)、抗菌素和胰蛋白酶、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-5-二苯基四氮唑溴盐 (MTT)、二甲基亚砜 (DMSO)等试剂均购自 Sigma和 Invitrogen公司。Annexin V-FITC试剂盒是 Calbiochem公司产品。

1.2 胀果甘草 GFs的制备

新疆胀果甘草 (Glycyrrhiza inflateBat.)从新疆甘草基地——巴楚县采摘并鉴定。胀果甘草 GFs从甘草根提取精制,其制备方法在研究组成员以往发表的文献中详细说明[3]。

1.3 GFs的含量测定

精制的胀果甘草 GFs的黄酮含量测定参照文献[3]。

1.4 离子阱电喷雾式质谱仪分析

利用离子阱电喷雾式质谱仪建立新疆甘草 GFs的指纹图普,质谱分析条件参照该仪器最佳技术指标,主要参数有电喷雾离子化 (ESI)源,毛细管温度为 150℃,脱溶剂气 (N2)流速为 350 L/h,锥孔气(N2)流速为 50 L/h,毛细管电压为 3.5 kV,扫描范围m/z:200～1000/50～350,锥孔电压为 30 V和 60 V,碰撞气体为氩气 (Ar),碰撞室能量为 30 V。

1.5 样品溶液的制备

将 GFs以 100%DMSO溶解后,用 RPM I1640培养基将药品稀释成各种我们所需的浓度,使每个样品的 DMSO浓度控制在 0.5%,经 0.22μm过滤器除菌后使用,并将 GFs重量与溶液体积之比定为药物浓度。

1.6 细胞培养

配制含 10%胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的 RP M I1640全培养基,在 5%CO2和37℃条件下培养 SiHa细胞,每隔 2～3 d更换培养基,待细胞融合度达 80%时,用胰蛋白酶 (0.25%)消化法以 1∶3或 1∶4比例传代。

1.7 MTT法测定细胞活力

取对数生长期的 SiHa细胞,接种于 96孔板 (密度为 2×105个 /mL),每孔 200μL,按预定浓度进行药物干预 20～24 h(经过预实验证明在药物干预 16～48 h之内,MTT测定结果变化不大,药物作用时间对结果影响不大)。次日,每孔加入 20μL MTT(5 mg/mL),并保持培养基的原体积不变。在 37℃和5%CO2细胞孵育箱培养 4 h后,弃去培养基,用 150 μL DMSO溶解细胞。待细胞内紫色结晶溶解后,利用酶标仪测定其 570 nm处吸光度值 (OD570),计算细胞存活率,并判断细胞活力。实验独立重复六次,计算平均值,运用 SPSS.17.0软件 t检验方法进行统计分析。

1.8 流式细胞仪检测细胞凋亡率

选择对数生长期的 SiHa细胞,以 1×106细胞 /孔的密度种植于 6孔板,培养 20～24 h和细胞融合度达到 70%～80%后,按预定浓度加入药物并继续培养。待药物干预结束后,收集细胞,参照 Annexin V-FITC试剂盒说明书处理细胞,并在流式细胞仪测定细胞凋亡率,主要包括细胞悬浮、结合 Annexin VFITC(1.25μL)和碘化丙啶 (PI,10μL),以及流式细胞仪检测。流式细胞仪分析条件:激发波长 Ex=488 nm;发射波长 Em=530 nm。实验独立重复三次,计算平均值,运用 SPSS.17.0软件 t检验方法进行统计分析。

2 结果

2.1 胀果甘草 GFs的含量测定

GFs为淡黄色粉末,GFs含量为 35.4%,与FeCl3反应显棕色。

2.2 胀果甘草 GFs的离子阱喷雾式质谱 (ESI-MS)分析

通过 ESI-MS全扫描分析,获得胀果甘草 GFs化学成分的指纹图谱 (图 1)。根据质合比推测,在甘草 GFs组分中可能含有异甘草素和甘草查尔酮A,分别与峰位值 256.25和 339.23相对应。

2.3 胀果甘草 GFs对 SiHa细胞生长与活力的影响

GFs主要含有脂溶性化合物,易溶于常规细胞培养试剂 DMSO。经 SiHa细胞毒性试验,我们将用于细胞药物干预的 DMSO终浓度范围定为 0.5+1.0%。以往的文献报道选择 490 nm为 MTT法检测波长。但是,我们多次测定后,发现 GFs在 570 nm波长处的自身光吸收值较低。

图1 新疆胀果甘草 GFs的 ESI-MS质谱特征Fig.1 ESI-MS Characteristics of GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflata

在 0～500μg/mL GFs的药物浓度范围内,随着GFs浓度的增高,发现 SiHa细胞的活性梯度性下降(表 1)。经多次试验,我们发现浓度在 150μg/mL GFs以内,检测结果具有很好的剂量-效应关系 (图3),并且 50μg/mL GFs是 SiHa细胞的最敏感浓度,浓度超过 150μg/mL GFs可以观察到 GFs自身吸收对检测信号的干扰。MTT方法鉴定结果反映了 GFs对细胞生长、繁殖、活性和细胞凋亡等综合效应,并证明该药具有潜在的抗宫颈癌活性。

表1 运用MTT方法检测新疆胀果甘草 GFs药物干预对 Si-Ha细胞生长与活力的影响Table 1 Effects of GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflataon Si-Ha cell growth and viability byMTTmethod

a平均值,设置 6次重复;b各组平均OD570值对正常对照组的百分比;+该组OD570值与正常对照组相比,其差异显著 (x±s,P＜0.05);+高浓度 GFs在 570 nm处有光吸收。

2.4 流式细胞仪方法鉴定胀果甘草 GFs诱导的 Si-Ha细胞凋亡率

通过荧光标记和流式细胞仪鉴定,可以直接评价细胞凋亡水平,并有利于消除黄酮类化合物自身光吸收的干扰。在 0+1000μg/mL GFs范围内进行SiHa细胞药物干预与鉴定,发现从起始浓度 100 μg/mL GFs开始,该药就引起细胞凋亡,其细胞凋亡率随着药物浓度增大而升高,并且具有较好的量效关系,最高凋亡率可达 78%(图 2、3与表 2)。GFs诱导细胞凋亡的效应与MTT法鉴定所提供的细胞活力变化趋势相吻合,进一步证明胀果甘草 GFs具有较强的抗癌活性。

表2 运用流式细胞方法检测新疆胀果甘草 GFs药物干预对 SiHa细胞凋亡的影响Table 2 Effects of GFs from XinjiangGlycyrrhiza inflataon Si-Ha cell apoptosis by FACSmethod

3 讨论

国内外对植物来源的抗癌活性成分的研究由来已久,从不同角度和程度揭示了某些植物类抗癌活性药物的可能作用机制。黄酮类化合物是一类低分子天然植物成分,有共同的母核 C6+C3+C6,包括黄酮类、黄酮醇类、异黄酮类、查尔酮类、双氢黄酮类、双氢查尔酮类等,具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、改善心血管功能、提高免疫力等广泛的生物学活性[4,5]。多种植物 GFs可以抑制细胞生长并诱导细胞凋亡,是黄酮类化合物抗肿瘤的重要机理之一[6]。

在寻找高效低毒的天然物质方面,甘草已成为倍受关注的植物之一。在甘草属植物中发现的黄酮类成分达 150多种。新疆地区拥有丰富的野生甘草资源和人工栽培基地,在甘草黄酮类化合物的提取工艺、成分鉴定和药理作用方面也有一些研究报道[3,7,8]。揭示甘草黄酮类化合物的抗癌作用机制,对单体活性组分的筛选与鉴定具有指导意义。

本研究选用新疆胀果甘草 GFs,其黄酮含量达35.4%。通过 ESI-MS质谱分析,对新疆胀果甘草GFs的指纹图谱进行鉴定,可以推测出异甘草素和甘草查尔酮 A等抗癌活性组分的存在。细胞药物干预实验和 MTT方法检测结果显示,在 25～100 μg/mL GFs范围时,就能对 SiHa宫颈癌细胞生长与活力产生抑制效应,其活力下降至 12%。为了进一步鉴定该药物对肿瘤细胞凋亡的单独作用,我们应用Annexin V荧光标记和流式细胞仪技术分析细胞凋亡率,发现在 100～1000μg/mL GFs范围内,该药诱导细胞凋亡,其最高凋亡率达 78%。通过细胞活力和细胞凋亡的分析,我们认为新疆胀果甘草 GFs含有抗癌活性成分,能够抑制肿瘤细胞生长、繁殖和活力,引起细胞凋亡。通过本课题研究,对胀果甘草GFs抗肿瘤生物活性做出了初步评价,为新疆胀果甘草 GFs活性组分的进一步筛选、分离以及从中研发新型抗癌药提供重要依据。

1 Pharmacopoeia of Uighur Medicine(维吾尔药志).Xinjiang:Xinjiang Publishing House of Science,Technology and Medicine,1999.185.

2 Hsu YL,Kuo PL,Lin CC.Isoliquiritigenin induces apoptosis and cell cycle arrest through p53-dependent pathway in HepG2 cells.Life Sci,2005,77:279-292.

3 Ma SY(马淑颜),Muhebuli A(木合布力·阿布力孜),Li XJ(季晓娟).Isolation,purification and determination of flavonoids from Xinjiang Licorica.Northwest Pha rm,2008,23:276-278.

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5 Zhang Y M(张玉萌),Zheng Z W(郑作文).Advances in the research of flavones on antitumor molecular mechanisms.Chin J D rug ApplM onit(中国药物应用与监测),2006,6:50-53.

6 Luo LP(罗丽萍),Gao YY(高荫榆),Hong XE(洪雪娥),et al.Study on anti-tumor effects of flavinoids extracted from sweet potato leaf,stalk and stem.Food Sci(食品科学),2006,27:248-250.

7 MuhebuliA(木合布力·阿布力孜),Mao XM(毛新民),Rena K(热娜·卡斯木),et al.Antioxidant activities of flavinoids from Xinjiang Glycyrrhiza glabra.Chin Pha rm J(中国药学杂志),2008,43:1617-1620.

8 Saliman H(赛力曼·哈得尔),Li HZ(李宏智),Muhebuli A(木合布力·阿布力孜),et al. Improvement of preparation technologyof glabridin from flavonoidsof XinjiangLicorica.Asia-Pacific TraditMed(亚太传统医药),2008,4(9):27-28.

Cytotoxic Activity of Flavonoids from Xinjiang Glycyrrhiza in flata Bat.

GUO Xia1,SHENG Lei1,Mourboul ABL ISE2,Abulizi A BUDULA3＊

1Xinjiang Key Laboratory of Molecular Biology and Endem ic Diseases;2Departm ent of Phar maco-chem istry;3Depar tm ent of Biochem istry and B iology,Basic Medical College,Xinjiang Medical University,U rum qi 830011,China

R931.6;Q949.751.9

A

1001-6880(2011)01-0049-05

2009-08-10 接受日期:2010-08-25

新疆维吾尔自治区重点实验室基金 (XJDX0208-2006-02)

＊通讯作者 Tel:86-991-4366435;E-mail:abulizi de@126.com