白雪冬,吴 敏,李遂焰

1西南交通大学生命科学与工程学院,成都 610031;2浙江大学生命科学学院,杭州 310058

一株嗜盐菌新种的分离与鉴定

白雪冬1,2,吴 敏2,李遂焰1＊

1西南交通大学生命科学与工程学院,成都 610031;2浙江大学生命科学学院,杭州 310058

从舟山册子岛船舶压载水泥样中分离到一株细菌 S3-22,其与已知细菌的 16S rDNA序列相似性低于97%,G+C mol%为 54.9 mol%,主要脂肪酸 iso-C17:1ω9c(24.99%),细胞醌型为甲基萘醌 MK-5。革兰氏染色阴性,最适生长条件为 30～37℃、pH 7、3%NaCl。嗜盐,氧化酶、接触酶、淀粉酶、酯酶呈阳性,可还原硝酸盐。依据其 16S rDNA序列相似性、系统发育学分析及细胞与分子水平的鉴定表明,该菌是Kordii monas属的一个新种,菌株 S3-22的 16S rDNA序列登陆号为 FJ847942。

嗜盐菌;新种;鉴定

Abstract:A marine bacterium,designated strain S3-22,was isolated from the ballastwater sample from Zhoushan archipelago,China.16S rDNA sequences similarity of strain S3-22 to all recognized bacterial species was not greater than 97%.The DNA G+C contentwas 54.9 mol%.The dominant fatty acid was iso-C17:1ω9c(24.99%).The major respiratory quinine wasMK-5.Cells of strain S3-22 were gram-negative.Optimal growth of strain S3-22 was at pH 7.0,30–37℃and 3%(w/v)NaCl.Itwas halophilic and tested positive for catalase,oxidase,amylase,and esterase.In addition,it could deoxidize the nitrate.Based on the evidence of 16S r DNA sequences similarities,phylogenetic analysis and cellular and molecular level identification,the halophile formed a phyletic lineage which was distinct from the knownKordiim onasspecies.Strain S3-22 represented a novel species in theKordiim onas,its Genebank Accession number was FJ847942.

Key words:halophile;novel;identification

海洋中的微生物种类丰富,基因组成和生物学功能具有多样性,使微生物能够适应海洋高盐、高压、低温、低营养和无光照等特殊区域生态环境。开展海洋微生物多样性的研究,对于丰富海洋生物基因资源库、开发海洋生物活性物质、保护和修复海洋生态环境等具有极其重要的意义。

1 材料和方法

1.1 材料

样品采自舟山册子岛 7万吨船舶压载水,半流动性泥样,含水率 44.3%,取样后 4℃保存。对照菌株为Kordiim onas gwangyangensisJCM 12864T,购自日本微生物保藏中心(Japan Collection ofMicroorganis ms,JCM)。

1.2 菌株的分离和培养

适量样品用含 Tween80(0.1%)的 Marine Broth2216(MB)培养基悬浮,30℃震荡 2～3 h,取上清涂布平板Marine Agar2216(MA),30℃培养 3 d,反复划线纯化获得单菌落。纯化后的菌株于 30%(v/v)甘油,– 80℃冰箱中保存。

1.3 16S rDNA序列的克隆及测序

1.3.1 基因组 DNA的提取

采用苯酚氯仿法[1]抽提基因组 DNA。获得的基因组DNA于– 20℃保存。

1.3.2 PCR扩增

使用细菌 16S rDNA通用引物 B1、B4,PCR程序为:95℃预变性 5 min,94℃变性 30 s,55℃退火30 s,72℃延伸 75 s,33个循环,72℃延伸 10 min,扩增产物进行单侧测序。测定的序列采用 Blastn和EzTaxon server 2.1[2]进行比对。单侧相似性低于97%的序列两端测序。序列拼接后长度大于 1300 bp,相似度仍低于 97%,定义为疑似新种。样品经过初步筛选,获得一个疑似新种,编号为 S3-22。

1.3.3 扩增产物的克隆及序列测定

菌株 S3-22的 PCR产物采用直接 TA克隆法[3]进行克隆。重组质粒测序结果通过拼接,获得菌株S3-22的 16S r DNA序列。

1.4 系统发育树的构建

将菌株 S3-22的 16S rDNA序列与从 GenBank数据库中获得的 16S r DNA序列利用 Blastn和 EzT-axon server2.1比对,采用 Clustal软件包进行多序列匹配排列,通过 MEGA 4.1[4]软件包,采用 Neighborjoining法构建系统发育树。

1.5 表型特征的观察

观察菌株 S3-22的菌落在培养基上的形状、大小、颜色、粘稠度、透明度、边缘和隆起情况,细胞革兰氏染色[3]等,记录结果。

1.6 G+C mol%含量的测定

提纯的DNA沸水浴中热变性,P1核酸酶 (340 U/mL)处理 DNA长链,37℃作用 2 h。小牛小肠碱性磷酸酶处理 6 h,pH 7.5-8.5,37℃。直接采用HPLC方法测定[5]。

色谱柱:ODS-AQ,Hydrosphere C18反相柱,4.6×250 mm;pH范围 2～7;流动相:12%甲醇,20 mmol/L三乙胺,磷酸调整 pH为 5.1。上样量 15 μL。色谱条件:流速 10 mL/min,柱温 37℃;检测波长 210 nm。标准 DNA:Salmon sper m DNA,(G+C)mol%=41.2%。

1.7 醌的测定

标准菌株Kordiim onas gwangyangensis[6]作为对照,甲醇∶氯仿 (1∶2,v/v)抽提冻干细胞,以正己烷∶乙醚 (34∶6,v/v)做层展剂,用 Vk做标准。展层后硅胶板在紫外灯下观察 (波长 245 nm),在绿色荧光背景下呈现褐色的条带即为甲基醌的位置。刮下条带,用氯仿溶解,收集上清,进行 HPLC分析。

层析柱:十八烷基硅烷;流动相:乙腈∶异丙醇 2∶12(v/v);流速:1 mL/min;柱温:40 ℃;柱压:90-100 kpa;检测:270 nm。

1.8 脂肪酸的测定

取一定量菌体置于无菌厌氧玻璃管中,逐一加入溶液Ⅰ(14.4 g氢氧化钠溶于 150 mL甲醇及 150 mL蒸馏水)、溶液Ⅱ(190 mL浓盐酸,275 mL甲醇溶于 135 mL蒸馏水)、溶液Ⅲ(200 mL正己烷与200 mL甲基叔定基醚混合均匀)、溶液Ⅳ(10.8 g氢氧化钠溶于 900 mL蒸馏水)处理。收集上层有机相,用 N2吹干。少量正己烷溶解,气相色谱-质谱联用仪分析样品[7]。

1.9 最适生长条件的测定

1.9.1 NaCl浓度影响

NaCl浓度范围 0%～20%(w/v),MB培养基,1%接种量,35℃培养。

1.9.2 pH影响

酸碱度范围 pH5-10,MB培养基,1%接种量,35℃培养。

1.9.3 温度影响

培养温度范围 4～48℃,MB培养基,1%接种量。

菌株 S3-22生长约 20 h至稳定期,测定 OD590吸光度,获得最适生长条件,绘制生长曲线。

1.10 生理生化特性研究

包括酶学、硝酸盐还原、产硫化氢、碳源利用等。采用 API20NE、APIZY M、API50CH和 API32GN鉴定系统进行测定[5-7]。

2 实验结果

2.1 菌株形态特征观察

菌株 S3-22接种于MB培养基 3 d后有明显菌落,菌落直径 1～2 mm,规则圆形,隆起,透明,鹅黄色,表面光滑湿润。电子显微镜观察菌体形态,为杆状,无鞭毛。

2.2 16S r DNA序列与系统发育分析

通过 TA克隆获得菌株 S3-22的 16S rDNA序列为 1419 bp,该序列已经提交到 GeneBank数据库,序列号 FJ847942。根据获取菌株 16S rDNA序列并进行比对之后构建系统发育树,可以看出菌株 S3-22与标准菌株Kordii monas gwangyangensis位于同一个分支上,进化距离最近,因此亲缘关系最近。TA克隆产物见图 2,系统发育树见图 3。

2.3 最适生长条件的测定

最适生长条件曲线见图 4～图 6。

2.4 主要特性分析

对菌株 S3-22和标准菌株Kordi imonas gwangyangensis的生长条件、革兰氏染色、酶学、硝酸盐还原、G+C摩尔含量、细胞醌型和脂肪酸的结果进行统计分析,具体实验结果见表 1。

表1 菌株 S3-22与K.gwangyangensis特性比较Table 1 Characteristic differences be tween strain S3-22 andK.gwangyangensis

2.5 碳源利用结果

采用API鉴定系统进行测定,结果表明菌株S3-22可以利用葡萄糖、海藻糖、纤维二糖、麦芽糖、谷氨酸、天冬氨酸、缬氨酸、精氨酸、酪氨酸、赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、丝氨酸、鸟氨酸、乙酸盐、苹果酸盐、琥珀酸等做为唯一碳源。

3 讨论

根据 16S rDNA序列相似性、系统发育分析、分子水平鉴定以及生理生化特性研究,判断菌株 S3-22为Kordiim onas属下的一个新成员,代表一个新的分类单元。Kordi imonas属目前只有一个有效种K.gwangyangensis。菌株 S3-22的 NaCl生长浓度为0.5%～7.5%,最适浓度 3%,轻度嗜盐,属于弱嗜盐菌。菌株 S3-22具有产生淀粉酶,明胶酶,酯酶,酪氨酸酶等活性物质的能力。由于菌株 K.gwangyangensis具有降解高分子芳香族化合物的特性,推测菌株 S3-22也具有相似特性,其性质还有待进一步研究。

目前对海洋嗜盐菌的了解还远远不够,虽然已有一些酶类从嗜盐菌中分离出来并进行了性质研究,但尚不能满足工业生产要求。在海洋生物资源探索备受瞩目的情况下,必定会有更多具有价值的海洋微生物被分离,获得更多的活性物质。对这些海洋微生物以及活性物质进行深入研究,无疑具有重要的研究意义和应用前景。

1 Xu XH(徐晓红 ),Wu M(吴敏 ),Cao Y(曹轶 ),et al.Isolation and phylogenetic analysis of halophilic archaea AJ6.J Zhejiang Univ,Sci Ed,2005,32(1):83-88.

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3 Shen P(沈萍).Microbiology(微生物学).Beijing:Higher Education Press,2000.267-272.

4 Kumar S,NeiM,Dudley J,et al.MEGA:a biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences.B rief B ioinfo rm,2008,9:299-306.

5 Schleheck D,Tindall BJ,Rossello MR,et al.Parvibaculu mlavamenti voransgen.nov.,sp.nov.,a novel heterotroph that initiates catabolism of linear alkylbenzenesulfonate.Int J Syst EvolMicrobiol,2004,54:1489-1497.

6 Kwon KK,Lee HS,Yang SH,et al.Kordiim onas gwangyangensisgen.nov.,sp.Nov.,a marine bacterium isolated from marine sediments that fo rms a distinct phyletic lineage(Kordiim onadalesord.nov.)in the’Alphaproteobacteria.’Int J Syst EvolM icrobiol,2005,55:2033-2037.

7 Kurahashi M,Fukunaga Y,Harayama S,et al.Sneathiella glossodoripedissp.Nov.,a marine alphaproteobacterium isolated from the nudibranch Glossodoris cincta,and proposal ofSneathiellalesord.nov.andSneathiellaceaefam.Nov.Int J Syst EvolM icrobiol,2008,58:548-552.

Seperation and I dentifi cation of a Novel Halophile

BA IXue-dong1,2,WU Min2,L I Sui-yan1＊

1College of Life Science and Engineering,Southwest Jiaotong University,Chengdu 610031,China;2College of Life Science,Zhejiang University,Hangzhou 310058,China

Q939

A

1001-6880(2011)01-0006-04

2009-11-23 接受日期:2010-03-30

国家重点基础研究发展规划资助项目(973计划)

＊通讯作者 Tel:86-28-87600965;E-mail:suiyanli_@163.com