味连基因组DNA提取方法研究

2011-10-09余弦王书林林海霞孙翠萍王砚

中药与临床 2011年3期

关键词：检测

余弦，王书林，林海霞，孙翠萍，王砚

DNA分子标记技术已广泛运用于中药的鉴定，高质量的DNA模板是进行PCR的重要前提，则DNA的提取是关键步骤。现在对中药DNA的提取主要利用新鲜植株进行提取，但从干燥药材中提取DNA的研究较少，因为中药材在其干燥、加工、贮藏等过程会造成DNA不同程度的降解。因此，如何从中药材中提取高质量的DNA模板是我们必须解决的问题。本课题在改良的CTAB法基础上对味连新鲜植株与干燥药材基因组总DNA提取方法进行了研究。

1 材料与方法

1.1 实验材料及预处理

干燥药材均打成细粉。一部分味连植株新鲜叶片(1、5、9、13、17、21 号)用 dd H2O 清洗后经液氮急速冷冻，再转入－80℃超低温冰箱保存;另一部分新鲜叶片(2、6、10、14、18、22 号)经 dd H2O 清洗后，擦干，剪成碎片，置于装有干燥变色硅胶的密封袋里，充分摇匀，使之迅速干燥，放于干燥器中保存。实验材料采集地点及编号见表1。

表1 实验材料采集地点及编号

高庙镇七里村 21～22号 23～24号洪雅 —— 25～26号重庆石柱 —— 27～28号

1.2 仪器

1.5 mL、2 mL离心管、研钵、Eppendorf精密移液器、Eppendorf centrifu ge 5417R高速冷冻离心机、电泳装置、核酸－蛋白凝胶图像分析管理系统、岛津紫外分光光度仪、Innova U101超低温冰箱、UPT超纯水器、磁力搅拌器、高精度低温恒温槽、pH计、通风橱等。

1.3 试剂

2×CTAB 提取缓冲液［2%CTAB，100 mmol·L－1Tris－HCl(pH8.0)，20 mmol·L－1EDTA，1.4 mol·L－1NaCl，2%巯基乙醇］、TE 缓冲液［10 mmol·L－1Tris－HCl(pH8.0)，1 mmol·L－1EDTA(pH8.0)］、5×TBE 缓冲液(pH8.3)［445 mmol·L－1Tris 碱，445 mmol·L－1硼酸盐，1 mmol·L－1EDTA(pH8.0)］、6×凝胶上样缓冲液(0.25%溴酚蓝，0.25%二甲苯青FF，30%甘油)、1.5%琼脂糖凝胶(琼脂糖1.5 g加至100 mL 0.5×TBE缓冲液中，加热溶解备用)、Mass RulerTMDNA Ladder Mix、溴化乙锭、氯仿、异戊醇、醋酸钠、无水乙醇、70%乙醇、dd H2O、液氮等。