徐晟伟，沈若武，张 蓓

(1青岛市第三人民医院，山东 青岛 266021;2青岛大学医学院)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)发病机制十分复杂。有学者认为该病是一系列免疫反应引起，与气道炎症、氧化反应等因素有关［1］。IL-2是一个与感染密切相关的细胞因子，它在机体启动免疫反应和炎症反应中起着放大作用［2］。本研究通过测定COPD患者血清中 IFN-γ、IL-2浓度以及 IL-2对CD8+T细胞频率和功能的影响，以期为临床治疗COPD提供理论基础。

1 资料与方法

1.1 临床资料 本研究78例均为2008年11月～2010年5月青岛市第三人民医院呼吸内科住院患者，均符合2007年中华医学会COPD诊治规范标准。按疾病的不同严重程度及不同时期将COPD患者分为急性发作期组45例、临床缓解期组33例。其中急性发作期组男28例、女17例，年龄55～81(62.4 ±7.9)岁;临床缓解期男18 例、女15 例，年龄57～78(64.2±5.6)岁。排除有支气管哮喘、支气管扩张、肺结核、肺间质纤维化等病史者。另选同期来我院查体健康者25例为对照组，其中男18例、女7 例，年龄(64.1 ±9.1)岁;均无吸烟史。

1.2 方法

1.2.1 IL-2、IFN-γ血清浓度检测 采用双抗夹心ELISA方法检测受试者血清IL-12、IFN-γ水平。取受试者血清及标准液各50 μl加入酶标板，37℃孵育30 min;每孔加酶标抗体 50 μl，37℃孵育 30 min。洗涤5次加底物显色;终止反应后，酶标仪测OD值。

1.2.2 IL-2对CD8+T细胞频率的影响检测 ①外周血单个核细胞(PBMC)的提取:取淋巴细胞分离液加入离心管，毛细吸管加入等量的倍比稀释血液，水平离心25 min。毛吸管轻轻吸取白膜层PBMC，洗涤后用含10%胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，培养于6孔板中备用。PBMC分为以下两组:IL-2刺激组，加入 IL-220 μl刺激;未刺激组，不加任何细胞因子刺激。孵育10 d后，检测CD8+T细胞频率。②CD8+T细胞频率检测:肝素抗凝全血200 μl加2 ml PBS 稀释后，1000 r/min 离心 5 min后移弃上清;加20 μl PE 标记的 CD3、20 μl FITC 标记的CD8抗体于全血细胞中，设置同型对照;室温避光孵育30 min，然后洗涤;加FACS裂解液室温10 min;待细胞悬液变成真性溶液后洗涤2次;1 g/ml多聚甲醛200 μl重悬固定，流式细胞仪检测，专用软件分析。③胞内IFN-γ染色提取的PBMC设不同刺激组，10 d后加入 20 μl PE 标记的 CD3、20 μl FITC标记的CD8单克隆抗体及同型对照，室温避光孵育20 min;加入500 μl 1× FACSTM TM 穿透液，室温下避光孵育15 min，洗涤1次;分别加入20 μl荧光标记的IFN-γ抗体及同型对照，室温下避光孵育20 min;洗涤2次，重悬于200 μl 1%多聚甲醛，上机检测细胞内富含IFN-γ的CD8+T细胞频率。

1.3 统计学方法 应用SPSS11.0统计软件;样本均数以表示;组间比较应用单因素方差分析或配对t检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血清中IL-2、IFN-γ浓度 COPD患者急性发作期血清IFN-γ、IL-2浓度较临床缓解期组和对照组显著增高(P均＜0.01)。临床缓解期组血清IFN-γ、IL-2浓度低于急性发作期组，但仍高于对照组(P均＜0.01)。见表1。

表1 三组血清IL-2、IFN-γ浓度测定结果 (ng/L，)

表1 三组血清IL-2、IFN-γ浓度测定结果 (ng/L，)

注:与对照组比较，*P ＜0.01;与临床缓解期组比较，△P ＜0.01

组别 n IL-2 IFN-γ急性发作期组 45 14.72±3.56＊△ 30.36±5.04＊△临床缓解期组 33 8.41 ±2.97* 16.28 ±4.39*对照组25 4.86 ±2.26 10.33 ±3.44

2.2 IL-2刺激组及未刺激组CD8+T细胞频率IL-2刺激组及未刺激组CD8+T细胞频率分别为(42.76 ±3.75)%、(36.71 ±2.81)%。与未刺激组相比，IL-2刺激组 CD8+T细胞频率增加(P＜0.05)。

2.3 IL-2刺激组及未刺激组CD8+IFN-γ+T细胞频率 IL-2刺激组及未刺激组CD8+IFN-γ+T细胞频率分别为(2.12 ±0.35)%、(1.31 ±0.2)%。与未刺激组相比，加入IL-2刺激组CD8+IFN-γ+T细胞频率显著增加(P＜0.05)。

3 讨论

COPD是一种由各种细胞产生的多种细胞因子及炎症介质介导的慢性炎症性疾病，其气道炎症以T淋巴细胞、巨噬细胞和中性粒细胞浸润为特征;在COPD患者的痰液和支气管肺泡灌洗液中这些细胞的数量增加也说明了这一点［3］。由于COPD是由多种炎性细胞参与的免疫反应性慢性炎症，所以有关COPD炎症反应和免疫反应过程中的细胞因子已经成为研究的热点。

IL-2、IFN-γ被认为是机体复杂免疫网络中起调节作用的重要细胞因子。IL-2属抗炎症因子，其主要生物活性是刺激自然杀伤细胞增殖与分化并杀灭微生物［4］;而IFN-γ是细胞免疫的重要效应因子，是CD8+T细胞杀灭病原微生物的重要方式之一。另外，IFN-γ能诱导细胞免疫，促进THI细胞增生与活化，可介导T细胞对AMs的激活，刺激AMs分泌细胞因子［5］。本实验结果显示COPD患者血清中IL-2、IFN-γ水平明显高于对照组，这与国外其他学者的报道一致［6］。而在临床缓解期，随着感染的缓解和控制，其释放量也相应减少，从而进一步说明IL-2、IFN-γ参与了COPD发生发展的过程。

目前的研究显示，在COPD患者的气道壁中，浸润的T淋巴细胞主要为CD8+T淋巴细胞，而且增加的CD8+T淋巴细胞数与COPD患者的气流受限程度相关，从而说明CD8+T淋巴细胞在COPD气道炎症发展过程中起着重要作用［7］。为揭示IL-2是否通过影响CD8+T淋巴细胞发挥免疫学效应，本研究设置不同分组观察其对CD8+T细胞频率的影响。结果显示用IL-2刺激后，CD8+T细胞频率显著增高，说明在COPD患者中，IL-2刺激了CD8+T细胞的增殖。

近年来研究提示，CD8+T细胞主要通过两种途径发挥免疫学效应:一种是CD8+T细胞对靶细胞的直接杀伤作用，即通过穿孔素和颗粒酶的释放等杀伤感染细胞;另一种途径主要是通过细胞因子的释放，如 IFN-γ和 TNF-α等，达到其免疫杀伤的目的［8］。为验证IL-2在促进CD8+T细胞频率提高的同时是否会改善其功能，我们利用流式细胞分析技术合并胞内细胞因子染色技术观察IL-2对不同组CD8+T细胞胞内IFN-γ分泌情况的影响，结果显示加入IL-2刺激后，CD8+T细胞分泌IFN-γ功能增强。

综上所述，COPD是一种由IL-2、IFN-γ等细胞因子介导的慢性炎症，而IL-2可通过促进CD8+T细胞增殖，同时刺激CD8+T分泌IFN-γ参与COPD的发生发展过程。

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