卢文丽 方肇勤 潘志强 梁 超 管冬元 吴中华 刘小美

上海中医药大学基础医学院 (上海，201203)

原发性肝癌是我国高发的恶性肿瘤之一，而中医药在肝癌的防治中，在改善患者生存质量、延长带瘤生存期等方面具有一定的优势。中医药防治肝癌的特点是辨证论治，即依据“同病异证”实施“同病异治”。揭示同病异证发生的物质基础是学术界长期以来一直关心的问题，也是探索和发展肝癌辨证论治方法的重要前提。

鉴于学术界以往研究证实中医常见证候与神经-内分泌系统有关［1，2］，同时该系统中甲状腺作为机体重要的内分泌腺与中医证候密切相关，而以往国内外肝癌防治研究中尚未涉及该层面，因此我们采用小鼠标准化、计量化检测方法，筛选出邪盛衰度不同的荷瘤小鼠，同时兼顾气虚证，检测其血清T3、T4激素水平，同步观察甲状腺激素合成密切相关的Tshr、Tpo、Tg、Nis等4个基因转录水平，有利于揭示肿瘤邪毒盛衰程度与甲状腺机能及其基因表达调控的关系。

1 材料与方法

1.1 动物与细胞株 昆明种小鼠，雄性，250只，体重22±2g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号为SCXK(沪)2007-0005，动物使用许可证号为SYXK(沪)2009-0069。小鼠H22肝癌细胞株购自上海中科院药物所。

1.2 主要试剂 小鼠总三碘甲状腺原氨酸 (T3)和小鼠总甲状腺素 (T4)ELISA试剂盒购自美国Calbiotech公司。Takara SYBR Premix Ex Taq购自大连宝生物工程有限公司，引物由上海英骏生物技术有限公司合成，以GAPDH作为内参：基因Tshr上游5'-GACAACGAGGACATGGTGTG-3'，下游5'-GGCTGGTTAGCAGAATGAGC-3'，产物长度154bp;基因Tpo上游5'-TGACTTCCAGGAGCACACAG-3'， 下 游 5'-CAGGAGGCCTCTCACTATCG-3'，产物长度 112bp;基因 Nis上游 5'-CCGATCAGTACATGCCATTG-3'，下 游 5'-CAGCTGCCATAGCGTTGATA-3'，产物长度132bp;基因Tg上游5'-CAGCCAGTCTTCTGTGGTCA-3'，下游 5'-TCTGTGAGGAGCGTGACATC-3'，产物长度 156bp;GAPDH上游 5'-TGTTCCTACCCCCAATGTGT-3'，下游5'-TGTGAGGGAGATGCTCAGTG-3'，产物长度400bp。

1.3 主要仪器 ROTOR GENE 3000实时荧光定量PCR系统(Corbett Research公司)，Elx800型酶标仪和Elx50型自动洗板机 (美国Bio-TEK公司)，FR-200A生物电泳图像分析系统(上海复日科技有限公司)。YLS-13A小鼠抓力仪 (山东省医学科学院设备站);SQF-EA体视显微镜 (上海万科仪器有限公司);WMY-01数字温度计 (上海华辰医用仪表有限公司);MP200B电子天平 (上海恒平科学仪器有限公司);0-125mm游标卡尺 (上海量具刃具厂);旷场检测小鼠实验笼用4.5cm×5.5cm方格 (课题组自制);NIKON4500数码相机等。

1.4 动物分组及处理 随机取20只作正常对照。另230只小鼠，全部腋下接种0.2 ml细胞液 (含细胞数为8×106个)。接种后第6天淘汰死亡、未出瘤、出瘤不佳小鼠10只，肿瘤小鼠220只。共计240只用于第7日四诊计量检测和辨证，筛选获得如下同病异证各证型肿瘤小鼠：①正常对照组 (简称正常组)，取气血阴阳盛衰度居中接近1.0者。肿瘤小鼠则以邪盛衰度大小排序，淘汰阳虚濒临死亡者。②邪毒壅盛濒危组 (简称濒危组)，取邪盛衰度最为严重，或兼有轻度阳气虚者。③邪毒壅盛组 (简称邪毒组)，取邪盛衰度次于上组，兼证少者。④邪毒居中兼气虚组 (简称气虚组，与邪毒居中组对照)。⑤邪毒居中组 (简称邪中组)。⑥邪毒微弱组 (简称邪微组)。

1.5 指标检测及处理

1.5.1 小鼠四诊计量化指标检测及辨证［3，4］进行检测、辨证分组。接种后第7天，四诊计量化检测指标包括：体重、腋温、旷场及计算35秒内水平跨格数和垂直站立数、抓力、爪和尾显微拍照及提取r值 ［r=R/(R+G+B)，photoshop图象处理后获得R、G、B值，R代表红色，G代表绿色，B代表蓝色;r值能反映小鼠爪尾的红色程度。］和肿瘤长短径。获得以上四诊数据后，辨证方法及标准如下：①估算瘤体积和瘤重 (cm3) =abb/2(a代表肿瘤的长径，b代表肿瘤的短径)，去瘤体重 (g) =体重-估算瘤体积 (假设肿瘤比重为1)。②邪盛衰度=各小鼠瘤重/所有小鼠瘤重均数。辨证标准：各荷瘤小鼠比较，＞2为邪毒壅盛; ＞1.5为邪毒甚，＜0.75为邪较弱; ＜0.5为邪弱。③气盛衰度=各小鼠水平移动实测值/正常组均数×0.3+各小鼠直立次数/正常组均数×0.2+各小鼠四肢抓力实测值/正常组均数×0.5。辨证标准：与正常组比较，＞1.5为气盛，＜0.75为气虚，＜0.5为气虚甚，＜0.25为气亏。④血盛衰度=爪r/正常组均数×0.7+尾r/正常组均数×0.3。辨证标准：与正常组比较，＞1.1为血充盈，＜0.95为血虚，＜0.9为血虚重，＜0.85为血亏。⑤阴盛衰度=各小鼠去瘤体重/正常组均值。辨证标准：与正常组比较，＞1.2为形丰，＜0.9为阴偏虚，＜0.85为阴虚，＜0.7为阴亏，＜0.6为液脱。⑥阳盛衰度=各小鼠腋温/正常组均数×0.3+各小鼠爪r/正常组均数×0.5+各小鼠尾r/正常组均数×0.2。辨证标准：与正常组比较，＞1.02为阳盛，＜0.98阳虚，＜0.95阳虚重，＜0.9阳损。根据以上辨证标准筛选获得不同组别小鼠。

1.5.2 测定小鼠血清甲状腺激素T3及T4 接种后第8天，动物处死前摘除眼球取血，制备血清，-80℃保存备用。采用ELISA试剂盒进行检测。

1.5.3 肿瘤重量测定 接种后第8天，引颈处死动物，取肿瘤组织，称重。

1.5.4 检测小鼠甲状腺相关基因mRNA水平［5，6］①接种后第8天，引颈处死动物，取甲状腺组织。②同组所有动物组织样本合并，常规采用Trizol抽提RNA、OD值测定、反转录(RT)、RTqPCR Real-time quantitative PCR及电泳。RTqPCR程序如下：95℃，30秒;95℃，15秒→60℃，45秒，40个循环。③采用△△CT法分析RTqPCR检测结果，以正常组作为对照样本。△△CT=(观察样本目的基因CT-观察样本内参CT)-(对照样本目的基因CT-对照样本内参CT)，样本的相对表达量 =2-△△CT。

1.6 统计学方法［7］采用SPSS 15.0统计软件进行数据统计分析。计量资料以(±s)表示，多组样本间比较采用单因素方差分析 (One-way ANOVA)，检验标准为0.05。方差齐采用LSD法，方差不齐采用Dunnett C法。

2 结果

2.1 一般情况 240只小鼠，第7天四诊计量化指标检测和辨证后，从正常组20只中筛选出14只，淘汰6只。从220只肿瘤小鼠中共筛选出80只，淘汰140只，其中濒危组21只，至次日自然死亡4只，第8日实际处死14只;邪毒组17只，至次日自然死亡3只，实际处死14只;气虚组小鼠14只，至次日自然死亡4只，实际处死10只;邪中组小鼠14只，至次日自然死亡1只，实际处死13只;邪微组小鼠14只，实际处死14只。各组入选小鼠第7～8日隔夜死亡率见图1。

图1 各组入选小鼠隔夜死亡率

2.2 各组小鼠处死时肿瘤重量 见表1。

表1 各组小鼠肿瘤大小比较 (±s)

表1 各组小鼠肿瘤大小比较 (±s)

与邪中组比较，▲P＜0.05

组别 n 肿瘤重量 (g)正常组14濒危组 14 2.56 ±0.64▲邪毒组 14 2.20 ±0.43▲气虚组 10 2.36 ±0.52▲邪中组 13 1.71 ±0.65邪微组 14 1.07 ±0.55▲

由表1可见，肿瘤小鼠的实际瘤重按濒危组、邪毒组、邪中组、邪微组依次减轻，与邪盛衰度趋势 (表2)十分类似，也提示活体体表测量及计算瘤体积方法的正确性;其中邪中组与其他组比较，差异有统计学意义 (P＜0.05)。值得注意的是，气虚组小鼠的肿瘤重量高于邪中组，可能与其气虚程度严重，肿瘤隔夜增长迅速有关。

2.3 各组小鼠证候及其程度 见表2。

表2 各组小鼠证候及其程度比较(±s)

表2 各组小鼠证候及其程度比较(±s)

与正常组比较，#P＜0.05;与邪中组比较，▲P＜0.05;与气虚组比较，★P＜0.05

组别 n 邪盛衰度 气盛衰度 血盛衰度 阴盛衰度 阳盛衰度正常组 14 1.03 ±0.18★1.00 ±0.01 1.00 ±0.03 1.00 ±0.01濒危组 14 1.66 ±0.21▲0.56 ±0.16#0.98 ±0.01#1.09 ±0.15 0.98 ±0.02#邪毒组 14 1.30 ±0.04▲0.72 ±0.21#★0.99 ±0.01#1.09 ±0.13 0.99 ±0.02气虚组 10 1.00 ±0.12▲0.41 ±0.08#1.00 ±0.02 1.09 ±0.09 0.98 ±0.02邪中组 13 0.95±0.15 0.91 ±0.11★1.00 ±0.02 1.08 ±0.08 0.99 ±0.01邪微组 14 0.39±0.13▲0.83 ±0.21★1.00 ±0.01 1.03 ±0.06 1.00 ±0.01

由表2可见：①邪盛衰度：濒危组、邪毒组、气虚和邪中组、邪微组等邪盛衰度依次减小。除气虚组与邪中组接近外，其余组别与之比较差异均有显著性意义 (P＜0.05)。②气盛衰度：与正常组比较，濒危组、邪毒组、气虚组差异有统计意义 (P＜0.05)。气虚组气盛衰度最小，除濒危组外，其他组与气虚组比较差异均有显著性意义 (P＜0.05)。依据气盛衰度辨证标准，小于0.5为气虚甚，表明本实验气虚组小鼠的气虚程度十分严重，这可能是其预后差的主要原因。③血盛衰度：与正常组比较，濒危组、邪毒组血盛衰度下降(P＜0.05)，但未达到血虚证标准。④阴盛衰度：各组间小鼠阴盛衰度比较，差异均无显著性意义 (P＞0.05)。⑤阳盛衰度：与正常组比较，濒危组阳盛衰度下降，差异有显著性意义 (P＜0.05)。但未达到阳虚证标准。

2.4 各组小鼠血清甲状腺激素T3、T4水平比较 见表3。

表3 各组小鼠血清甲状腺激素水平比较(±s)

表3 各组小鼠血清甲状腺激素水平比较(±s)

与正常组比较，#P＜0.05;与邪中组比较，▲P＜0.05

组别 n T3(ng/ml) T4(μg/dl)正常组 14 2.007 ±0.157 6.967 ±0.180▲濒危组 14 1.663±0.166▲ 3.143±0.571#▲邪毒组 14 1.774 ±0.315 3.155 ±0.826#▲气虚组 10 1.876 ±0.270 3.425 ±0.901#▲邪中组 13 2.090 ±0.131 4.396 ±0.716#邪微组 14 2.106 ±0.119 5.927 ±0.560#▲

与正常组比较，T3在肿瘤早期、在邪微组和邪中组，有升高趋势，而随着邪盛衰度程度增加，则出现下降趋势，但差异无显著性意义 (P＞0.05);濒危组较邪中组T3下降 (P＜0.05)。而T4在肿瘤发生后迅速抑制，与正常组比较，各组均出现下调 (P＜0.05);其中邪中组与其他组比较，差异有显著性意义 (P＜0.05)。

2.5 各组小鼠甲状腺激素合成关键基因RTqPCR检测结果见图2～9。

图2 各组小鼠Tshr相对表达量

图3 各组小鼠Tpo相对表达量

图5 各组小鼠Tg相对表达量

图6～9注：M：marker;1：正常组;2：濒危组;3邪毒组;4气虚组;5邪中组;6邪微组。Marker中最亮条带为500bp，往下逐渐减少100bp。

分析图2～图9：①Tshr：由图2可见，与正常组比较，Tshr的表达在濒危组、邪毒组和气虚组出现递减趋势，邪中组、邪微组表达量呈递增趋势。其中气虚组表达量最低，而邪微组表达量最高。电泳条带见图6。②Tpo：由图3可见，与正常组比较，Tpo的表达气虚组明显下调，邪微组则明显上调。电泳条带见图7。③Nis：由图4可见Nis的表达与正常组比较，濒危组、邪毒组、气虚组、邪中组均出现明显下调，邪微组则明显上调。电泳条带见图8。④Tg：由图5可见，Tg的表达在邪毒组、邪中组、气虚组均有下调趋势，且气虚组表达量最低;邪微组明显上调。电泳条带见图9。

3 讨论

笔者在以往长期的研究中发现，常见疾病实验动物如肿瘤小鼠，存在着类似于人类的证候的自然发生和同病异证的表现［3，4］：如给昆明种小鼠腋下接种同样浓度和剂量的H22腹水癌细胞后，在小鼠出瘤的早期，肿瘤体积差距很大：部分动物早期肿瘤生长迅速，瘤体积大，死亡早，预后差，类似人类临床“邪毒壅盛证 (型)”;此外，除肿瘤“痰、热、瘀、毒”等邪毒的基本证候外，肿瘤发生后，荷瘤小鼠会自发形成气、血、阴、阳等虚证表现，并随着病情发展和邪盛衰度严重而加剧［8］。如肿瘤早期出现“气虚证”，表现为肿瘤相对较小，自主活动减少、抓力下降等证候。

本次所筛选不同组别H22荷瘤小鼠证候情况如下：邪盛衰度方面，濒危组、邪毒组、气虚和邪中组、邪微组等邪盛衰度依次减小;气盛衰度总体上与邪盛衰度呈正相关，其中气虚组最为严重;各证候未见阴虚证兼夹情况;血盛衰度、阳盛衰度总体上与邪盛衰度呈正相关，其中濒危组两证候均出现下降，但均未达到相应的辨证标准。

甲状腺激素水平方面，在肿瘤早期邪毒程度较轻者，如邪中组和邪微组，T3与正常组接近且有升高趋势，而随着邪盛衰度程度增加，则出现下降趋势;T4在肿瘤发生后迅速出现抑制，随着邪盛衰度越重抑制越甚。以上结果提示：肿瘤发生后，机体甲状腺总体处于抑制状态，且邪盛衰度越重抑制越甚。

Tshr、Tpo、Nis、Tg为甲状腺重要的功能标志性基因［9，10］：甲状腺激素的合成和分泌主要受到甲状腺上游组织垂体的调控，Tshr与垂体分泌的Tsh相结合而启动该过程;Tpo参与甲状腺激素合成中碘的活化及碘化酪氨酸耦联;Nis在甲状腺激素合成中对碘的主动转运起重要作用;Tg是甲状腺激素的前体。以上基因RTqPCR检测结果存在如下总体趋势：①不同邪盛衰度，程度轻者表达量相对较高，程度重者表达量相对较低，如邪中组和邪微组表达量多较高。与甲状腺激素变化趋势大体一致。②气虚组表达量多为最低，可能与该组气虚程度严重，隔夜肿瘤生长迅速，实际邪盛衰度增加，死亡率较高有关。

以上结果综合提示：①肿瘤邪盛衰度与荷瘤小鼠甲状腺抑制程度有关。当邪毒微弱时，甲状腺尚处于积极的代偿状态;随着肿瘤邪盛衰度的增加，甲状腺转而出现失代偿状态，呈现抑制，是因实致虚。②同病异证H22肝癌小鼠甲状腺激素水平变化，总体上与激素合成Tshr等关键基因变化一致，提示肿瘤发生后激素合成关键基因亦发生相应变化，从而影响了甲状腺激素水平。

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