刘若男 王莉莉 王莉英 李秀荣 张靖 陈奎生

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤，由于卵巢癌发病隐匿，患者临床明确诊断时大多数已经是晚期，严重影响患者的生命健康。Livin是新近发现的一种凋亡抑制蛋白家族(IAPs)成员，与Caspase结合发挥抗凋亡作用，其在正常成人组织中低或无表达，在某些恶性肿瘤细胞和转化细胞中高表达，该基因可能在肿瘤的发生和发展中起着重要作用[1]。本实验通过免疫组化SP法检测Livin蛋白和Caspase蛋白在良、恶性卵巢上皮性肿瘤组织中的表达，旨在探讨Livin和Caspase在卵巢癌发生发展的关系，为临床治疗及提高患者的生存率提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集河南省肿瘤医院病理科保存的2006年1月至2008年3月原发性上皮性卵巢肿瘤石蜡标本100例，临床资料完整。其中恶性肿瘤76例，作为卵巢癌组，年龄24～72岁，平均年龄(52.80±8.45)岁，术前均未接受过化疗或放疗。组织学分型:浆液性囊腺癌46例，粘液性囊腺癌24例，子宫内膜样腺癌6例。恶性卵巢肿瘤按FIGO分期标准(1988年):I期8例，II期16例，III期44例，IV期8例。组织学分级:高分化(G1)20例，中分化(G2)30例，低分化(G3)26例。另取良性卵巢上皮性肿瘤24例作为对照组，其中浆液性囊腺瘤18例，粘液性囊腺瘤6例。

1.2 方法 采用免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶染色法(SP法)。严格按照说明书进行操作。

1.3 结果判定 参照文献[2]，光学显微镜下 Livin及Caspase-3免疫组化产物呈棕黄色细颗粒状，定位于胞质，偶见于胞核。随机观察清晰的10个高倍视野，根据阳性细胞所占视野所有肿瘤细胞的百分比计算出每例标本的Livin及Caspase-3表达率。根据其表达率及染色强度分别记为:(-)无明显阳性反应细胞或阳性细胞面积小于10%，染色浅;(+)阳性细胞面积大于10%，但小于50%，染色较深;(++)阳性细胞面积大于50%，染色深。

1.4 统计学方法 所有数据均采用SPSS 12.0统计软件处理，计数资料采用χ2检验，等级资料的组间比较采用秩和检验，分析两指标的相关性采用Spearman等级相关分析，以α=0.05作为检验水准。

2 结果

2.1 Livin及Caspase-3蛋白在卵巢癌组及对照组中的表达卵巢癌组Livin蛋白表达率为81.58%，对照组33.33%，两组之间差异具有统计学意义(P＜0.05)。Caspase-3在卵巢癌组及对照组表达的阳性率分别为47.37%和83.33%，两者之间差异具有显著性(P＜0.05)。

2.2 卵巢癌中Livin蛋白表达与临床病理因素的关系Livin蛋白在卵巢癌Ⅲ～Ⅳ期的表达率明显高于Ⅰ～Ⅱ期(P＜0.05)，且肿瘤分化程度越低，Livin蛋白表达越强(P＜0.05)，伴淋巴结转移者明显高于无淋巴结转移者(P＜0.05);但与卵巢癌的组织学类型无关(P＞0.05)，见表1。

表1 Livin蛋白表达与卵巢癌临床病理指标的关系

2.3 卵巢癌组织中Livin与Caspase-3蛋白表达的相关性分析 在62例Livin蛋白表达阳性的卵巢癌组织中，Caspase-3蛋白的阳性表达率为41.94%(26/62);在14例Livin蛋白阴性表达组中，Caspase-3蛋白的阳性表达率为71.43%(10/14)。经Spearman相关分析表明二者为负相关(χ2=3.981，P＜0.05，r=-0.223)。

3 讨论

多细胞生物体细胞数量恒定取决于细胞增殖与凋亡间的动态平衡，破坏平衡可导致肿瘤的发生。在恶性肿瘤病变中，细胞增殖和凋亡同时增加，但增殖速率明显大于凋亡速率。当抑制肿瘤细胞增殖和/(或)促进肿瘤细胞凋亡，则会影响肿瘤的生长。Livin基因是一个新近发现的凋亡抑制基因，具有强大的凋亡抑制功能，其异常表达与多种人类肿瘤的发生发展及预后密切相关[3]，成为人们研究的一个热点。

Livin是IAP家族中新近发现的一种凋亡蛋白，Livin基因位于人染色体20q13.3，全长4.6kb，包含7个外显子和6个内含子。Livin抗凋亡活性就主要依赖于其BIR结构域。Livin在正常成人的大多数组织中(除胎盘)均不表达，表皮、淋巴、脾脏和黑色素细胞表达很低。在胎儿发育过程中多种组织高表达，如胎儿的脑、胸腺、肾和肝。Livin可能需要通过一系列的凋亡刺激物的作用来表现凋亡的抑制，其抑制凋亡的信号通路包括:外在途径即细胞表面的死亡受体，内在途径即细胞色素C依赖途径和化疗药物途径;细胞在接受到足够的凋亡刺激信号后，Caspase-3、-7、-9的酶水解作用被激活而执行凋亡功能[4]。另有研究报道，Livin的RING指结构可引起Caspase蛋白的降解，发挥其抗凋亡作用。

大量研究表明，Livin的分布具有肿瘤组织特异性，在一些癌细胞系中呈现高表达，如淋巴瘤、HaCat细胞、MCF7乳腺癌细胞、前列腺癌、白血病以及宫颈癌、结肠癌、膀胱癌等，尤其在黑色素瘤细胞系C361和SK-Me129中表达水平最高[5]。本研究用免疫组化SP法检测Livin蛋白在24例良性卵巢上皮性肿瘤、76例卵巢癌组织中，阳性表达率分别是33.33%和81.58%，卵巢癌组织中Livin蛋白表达明显高于良性卵巢上皮性肿瘤，表明Livin和卵巢癌的发生、发展密切相关。提示Livin表达发生在卵巢癌恶性转化的早期，表明Livin与卵巢癌的发生有关。Livin在卵巢癌组织中的表达可能抑制了异常突变的细胞的凋亡，从而扰乱了细胞生长和凋亡途径，促使细胞逃离生长监控，导致肿瘤的发生。

国外许多研究表明，凋亡抑制因子Livin与多种肿瘤的预后及患者的存活时间密切相关，其表达程度与病程进展和不良的组织学相一致[6]。研究发现低分化卵巢癌中细胞凋亡明显低于中、高分化卵巢癌，且存在多种调节因子的紊乱，认为凋亡及其调节因子的紊乱与卵巢癌的恶性行为有关，并影响预后。本研究中卵巢癌组织分化程度越低，其Livin蛋白表达越强，而Ⅲ、IV期卵巢癌组织中Livin表达显著增高则进一步证实了这一点。Livin通过抑制肿瘤组织中正常细胞凋亡的作用，促进癌细胞增殖，进而增加了癌细胞的侵袭能力，其在肿瘤细胞中表达越高，对凋亡的抑制能力就越强，肿瘤细胞的存活能力和恶性程度就越高，就更易侵袭周围组织而发生转移。

Caspase蛋白家族是细胞内执行凋亡过程中最关键的环节之一，Caspase-3是细胞凋亡过程中的主要效应分子，它可以单独或协同参与水解许多与凋亡有关的蛋白质。Caspase-3活化主要有两条途径:一是经细胞表面膜受体如Fas、TNFR1等活化;另一条途径是死亡刺激因子作用下线粒体释放细胞色素C。活化的Caspase-3执行效应Caspase的作用，非选择性分裂水解其他蛋白、内源性核酸内切酶以及本身，激活DNA片断因子，导致DNA降解、核浆碎裂、细胞凋亡[2]。本研究显示Caspase-3蛋白在24例良性卵巢上皮性肿瘤、76例卵巢癌组织中，阳性表达率分别是83.33%和47.37%，卵巢癌组织中Caspase-3蛋白表达明显低于良性卵巢上皮性肿瘤组织，提示Caspase-3和卵巢癌的发生、发展密切相关Livin与Caspases结合有高度的亲和性和特异性，这依赖于BIR结构域的完整。BIR是一种新型的锌指结构，而Livin中BIR结构是抗凋亡活性所必需。如BIR结构域单个氨基酸发生突变可导致 Livin与Caspases亲和力下降，使Livin的抗凋亡能力明显减低甚至消失[7]。另有研究报道，Livin的RING指结构可引起Caspases蛋白的降解，发挥其抗凋亡作用。本实验结果表明，经Spearman相关分析发现，卵巢癌组织中Livin与Caspase-3蛋白表达呈明显的负相关。提示在卵巢癌的演变过程中Livin可能直接作用于Caspase-3并抑制其活性，阻断细胞的凋亡过程，从而促进了卵巢癌的癌细胞不断增殖。

Livin与Caspases的异常表达与卵巢癌的发生、发展密切相关，Livin在卵巢癌中的高表达与淋巴结转移及临床病理分期密切相关，可能是影响卵巢癌预后的重要分子指标，有关Livin与Caspases对卵巢癌的发生、发展的详细机制还需进一步研究。

[1]Nachmias B，Mizrahi S，Elmalech M，et al.Manipulation of NK cytotoxicity by the IAP family member Livin.Eur J Immunol，2007，37(12):3467-3476.

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[3]Liu P，Wang TS，You SH，et al.Expression of livin in gastric dancer and effect of silencing of the livin gene on apoptosis in gastric cancer cells.Zhonghua Zhong Liu Za Zhi，2007，29(8):570-574.

[4]Li JH，He WJ，He YJ.Expression and clinical significance of Survivin and Livin in Dukeso B colorectal cancer.Ai Zheng.2007，26(5):547-551.

[5]焦伊胜，王永来，张淑兰，等.Livin、Smac在上皮性卵巢癌中的表达及意义.现代肿瘤医学，2009，17(02):0296-0299.

[6]Crnkovi Mertens I，Semzow J，et al.Isoform-specific silencing of the Livin gene by RNA interference defines Livin beta as key mediator of apoptosis inhibition in HeLa cells.J Mol Med，2006，84(3):232-240.

[7]朱红玲，周家德.Survivin和Caspase-3在卵巢上皮性癌中的表达.中国妇幼保健，2008，23(13):1860-1864.