王伟斌

随着高龄人口和脑卒中存活率的增高，血管性痴呆(VD)的发病愈来愈多。由于生理浓度的钙离子作为神经细胞内第二信使，参与了学习和记忆过程;因此，神经细胞［Ca2+］i研究一直倍受人们关注。

1 材料与方法

1.1 动物模型制备与分组 实验动物选用2月龄雄性昆明小鼠。采用双侧颈总动脉结扎再灌注的方式制备VD模型;假手术组仅暴露双侧颈总动脉;治疗组先制备模型，术后第2天给予石杉碱甲0.05 μg/g/d 30 d。

1.2 学习、记忆成绩测试 跳台试验装置为被动回避反应箱，术后第29天测试学习成绩，记录动物反应时间、错误次数;24 h后测试记忆成绩(潜伏时间及错误次数)。

1.3 LSCM下观察神经细胞静息态［Ca2+］i及其去极化兴奋时的钙震荡 将小鼠断头处死，在低温下分离出海马组织，制备海马活细胞。滴加荧光探针Fluo-3(浓度1000 mM)1 μl，在Bio-Rad MRC-1024型LSCM下，对锥体细胞进行激光扫描观察，数据为细胞内荧光像素的相对值;观察静息态［Ca2+］i后，加入20 μl 50 mmol/L氯化钾溶液，观察神经细胞的钙震荡变化，记录其［Ca2+］i的上升时间、下降时间以及升高的峰值和幅度。

1.4 数据分析 采用单因素方差分析，运用SAS软件进行处理，并采用SNK法进行3组之间的两两比较。

2 结果

2.1 跳台试验 表1可见，模型组的学习成绩和记忆成绩均劣于假手术组，治疗组的学习成绩和记忆成绩均优于模型组。

2.2 海马神经细胞钙稳态变化 表2可见，模型组静息态［Ca2+］i显著高于假手术组、治疗组，并且去极化后海马神经细胞［Ca2+］i升高幅度明显降低，恢复时间明显延长。

表1 各组小鼠学习和记忆成绩比较

表2 海马神经细胞［Ca2+］i荧光像素相对值比较

2 讨论

VD是因脑血管疾病所致的认知功能障碍综合征。近几年来，对其发病机制及治疗的研究愈来愈多。本实验采用双侧颈总动脉线结法造成脑组织反复缺血-再灌注损伤，并且经行为学测试存在学习和记忆功能障碍，是比较理想的血管性痴呆动物模型。

VD小鼠海马神经细胞钙稳态失衡，表现为：静息态［Ca2+］i升高，去极化时升高幅度降低、恢复时间延长。与小鼠学习和记忆成绩降低相一致，可能参与了VD的分子生物学发病机制。静息态［Ca2+］i升高可以促进神经元凋亡或迟发性坏死，进而降低了海马参与学习和记忆的功能［1］。同时，海马神经细胞静息态［Ca2+］i过高可能升高了突触传递的阈值，易化突触的抑制，降低突触传导、神经递质释放、信号转导等，从而导致了学习记忆功能障碍。去极化时［Ca2+］i升高幅度降低反映了Ca2+内流减少，降低了突触后神经细胞内Ca2+引起的激酶激活及参与学习和记忆的基因转录，降低了神经递质和突触素的合成，导致LTP的诱导和维持障碍，出现学习和记忆功能受损［2］。并且，VD小鼠海马神经元受刺激后，［Ca2+］i持续升高，恢复到静息态水平的时间较长，从而使细胞凋亡基因的启动、突触传递的阈值升高、钙依赖性激酶的激活减少等进一步加重。至于石杉碱甲改善VD海马神经细胞钙稳态的机理尚在探讨中。有学者研究，石杉碱甲具有神经细胞NMDA受体拮抗作用，并且这种作用与其胆碱酯酶抑制作用无关系;其与非竞争性NMDA受体拮抗剂MK-801的作用没有明显差别［3］。Gordon等进一步研究，石杉碱甲通过NMDA受体拮抗作用减轻兴奋性氨基酸的毒性及继发的Ca2+内流，从而减轻缺血缺氧引起的神经元变性、坏死;这种作用对M型或N型乙酰胆碱受体及腺苷受体无影响［4］。

因此，我们认为：在石杉碱甲的治疗作用下，VD海马神经细胞钙稳态受缺血缺氧影响不明显，从而可以维持钙稳态于正常水平，使神经细胞及其生理功能免于损伤。

［1］Saski C，Kitagawa H.Temporal profile of cytochrome C and caspase-3 immunoreactives and TUNEL staining after permanent middle cerebral artery occlusion in rats.Neurol Res，2000，22(2)：223-228．

［2］徐虹．韩太真与长时程增强相关的基因表达的研究进展生理科学进展，2001，32(2)：174-176．

［3］hang YH，Chen XQ.Similar potency of the enantiomers of huperzine A in inhibition of［(3)H］dizocilpine(MK-801)binding in rat cerebral cortex.NeurosciLett，2000，295(3)：116-118．

［4］gordon RK，Nigam SV.The NMDA receptor ion channel：a site for binding of Huperzine A.J ApplToxicol，2001，21(Suppl 1)：47-51．