李树贵,于海翔,杨 光*

(1.柳河县医院外四科,吉林柳河 135300;2.吉林大学中日联谊医院）

骨髓间充质干细胞(MSCs）是一种来源于骨髓的成体干细胞,具有自我更新和多向分化能力。它不仅能分化为中胚层的成骨细胞、软骨细胞和脂肪细胞等,近年的研究还发现可跨胚层分化为肝细胞[1]、神经细胞[2、3]、心肌细胞[4],因而引起了更广泛的关注,已成为组织工程、基因治疗和再生医学中的研究热点。在体外成功分离培养MSCs是研究其分化机制、基因调控、乃至实验应用的前提。我们采用贴壁法分离培养大鼠骨髓来源的间充质干细胞(BMSCs）,观察其生物学特性和多向分化能力,并给予鉴定,为下一步实验应用提供依据。

1 材料和方法

1.1 实验动物和主要试剂

选取出生5-7天的清洁级Wistar大鼠(体重6.0-8.0 g）,由吉林大学基础医学院动物实验中心提供。低糖DMEM培养基(GIBCO公司）、标准胎牛血清(GIBCO公司）、胰蛋白酶(Sigma公司）。

1.2 骨髓间充质干细胞的分离提取

将新生大鼠颈椎脱臼处死后,放入75%的乙醇内浸泡5 min。无菌条件下取出双侧股骨,去除附带组织,两端剪断暴露骨髓腔。以1 ml注射器吸取低糖DMEM细胞培养液反复冲洗,至骨质发白为止,将所收集的细胞悬液用200目滤网过滤,制备成单细胞悬液。细胞计数后以1.0×106/ml接种到含20%胎牛血清的低糖DMEM细胞培养液的培养瓶内。

1.3 骨髓间充质干细胞的传代培养和扩增

培养瓶置于37℃、5%CO2培养箱中静置培养。5天后首次半量换液,以后根据培养液颜色变化,每隔3-4天更换全部培养液1次。在贴壁细胞80%-90%融合……