邢 跃,王红月,窦海川,崔明姬*

(1.吉林大学中日联谊医院神经内二科,吉林长春 130033;2.吉林大学第一医院肾内科,吉林 长春 130021）

高同型半胱氨酸血症是动脉粥样硬化(AS）性血管疾病形成的独立危险因素,但其机制至今不完全清楚。起初,人们大都致力研究于同型半胱氨酸(Hcy）对内皮细胞的毒性作用,发现Hcy可损害内皮细胞,影响其舒张功能,近年来,研究发现一定剂量的Hcy能诱导血管平滑肌细胞(VSMC）的增殖,而VSMC的异常增殖是AS性血管性疾病发生过程中重要的病理现象[1]。然而,VSMC的增殖又并存着VSMC凋亡,VSMC增殖与凋亡是维持血管壁细胞相对稳定的一对基本因素,其调节失控是AS的主要原因之一。本研究观察Hcy对体外培养的人VSMC凋亡和凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax及Caspase-3表达的影响,进一步探讨Hcy导致AS的机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂与仪器

DMEM、胎牛血清、新生牛血清(Gibco公司提供）、胰蛋白酶、转铁蛋白(Sigma公司）、医用胰岛素、EDTA、青霉素 、链霉素、D-Hank′s 液、PBS 液、DBA液,兔抗人α-actin抗体(武汉博士德公司提供）、同型半胱氨酸(Sigma公司提供）、PI/Annexin V凋亡检测试剂盒(Sigma公司提供）、RNA提取试剂TR IZOL(Invitrogen）、dNTP、Taq酶(美国Promega公司提供）,PCR试剂盒(美国Promega公司提供）,引物赛百盛公司合成。全封闭PCR紫外透射仪(上海精科实业有限公司）紫外与可见光分光分析仪(HITACHI u-2000型,日本）FACS Calibur型流式细胞仪(美国BD公司）。

1.2 人VSMC的体外培养、鉴定及实验分组

取无菌新鲜脐带,采用贴块法培养人VSMC,细胞鉴定用第5代细胞,倒置显微镜下观察细胞形态,行α-actin免疫组化检测。取5-10代细胞用于实验。

将人VSMC细胞分别置于Hcy终浓度为0 μ mol/L 、150 μ mol/L、250 μ mol/L 、550 μ mol/L、1 000 μ mol/L,1 550 μ mol/L,即 6个浓度组 ,每个浓度组设6个培养孔,培养24 h,同时设阴性对照组(磷酸盐缓冲液组）和阳性对照组(脂多糖组）。……