赵劲松,黄岚峰,王淑荣

(吉林大学第二医院 1.眼科医院 眼底病一科;2.骨科,吉林 长春 130041）

Interphotoreceptor matrix(IPM）是视网膜色素上皮细胞顶端和外界膜之间存在的细胞外基质,在视功能中很多生物学反应都是通过这个视细胞外间质起着重要作用,比如视色素转运,代谢产物的运输,细胞间信息交流,光感受器分化调节和排列等。IPM化学成分主要有透明质酸和蛋白质,其中分子量为150kDa的sialoprotein associated with cones and rods(SPACR）为主要蛋白质[1],迄今为止关于SPACR的研究尚不多。为进一步研究SPACR的功能,本文建立了从视网膜分离提纯SPACR蛋白的技术,期待为进一步研究SPACR活性、结构及功能奠定基础。

1 材料与方法

1.1 动物SPACR是不溶于PBS的蛋白质[1],取白来杭鸡视网膜,按照[1,2]获取白来杭鸡不溶于PBS的IPM成分。

1.2 试剂和仪器DEAE-Sephacel来自Amersham Biosciences,Sephacryl S-300 HR来自Amersham Biosciences,Mini-Protean II 2-D系统、SDS-PAGE电泳装置及电泳胶来自Bio-Rad。所有试剂均来自Bio-Rad公司和国产分析纯。SPACR抗体O46-F由日本Dr.Zako惠赠,其二抗peroxidase-conjugated protein A(1:3000）来自ICN.

1.3 缓冲液配制

1.3.1 组织裂解液配制 50 mM Tris-HCl pH 8.0,10 mM EDTA,1 mM PMSF,7 M urea,0.5%Triton X-100。

1.3.2 双向电泳上样缓冲液配制 1.6%Bio-lyte 5/7 ampholyte,0.4%Bio-lyte 3/10 ampholyte,9.5 M urea,2.0%Triton X-100,5%β-mercaptoethanol。

1.3.3 双向0.9×57-mm管状凝胶制作配方 Urea 5.5g,丙烯酰胺储存液(acrylamide）1.33ml,10%(w/v）Triton X-100 2ml,40%Bio-lyte 5/7 ampholyte 400 μ l,40%Bio-lyte 3/10 ampholyte 100 μ l,10%过硫酸铵(APS）10 μ l,N,N,N',N'-四甲基乙二胺(TEMED）10 μ l,加水至10 ml。(终浓度 9.2 Murea,4%acrylamide,2.0%Triton X-100,1.6%Bio-Lyte 5/7 ampholyte,and 0.4%Bio-Lyte 3/10 ampholyte,0.1%TEMED,0.01%APS）。

1.3.4 双向电泳平衡缓冲液 62.5 mMTris-HCl,pH 6.8,2.3%(w/v）SDS,5.0%(v/v）β--mercaptoethanol,10%(w/v）glycerol。

1.3.5 透析液 4M guanidinium chloride,0.5%Triton X-100,50 mM Tris-HCl pH 8.0。

1.4 方法

1.4.1 DEAE-Sephacel离子交换层析 颈部脱臼法处死白来杭鸡,在解剖显微镜下,冰上操作,按照Acharya[1,2]方法获取不溶于PBS的IPM成分作为粗提物,并重新溶于裂解缓冲液,4℃充分匀浆12 h,15000 rpm,4℃离心30 min,取上清液并上样于平衡过的DEAE—Sephacel离子交换柱(5 cm×50 cm）,上样后用初始缓冲液充分洗净未吸附的蛋白质,再用含有0.15-1M NaCl的缓冲溶液进行梯度洗脱并收集各组分,用紫外分光光度仪分别检测每管样品的A280值,并用Western blot法测定SPACR所在之处。……