马艳平,刘振兴,郝 乐,林 敏,孟 轩,柯 浩

(广东省农业科学院兽医研究所广东省兽医公共卫生公共实验室,广东广州,510640)

核酸扩增是生命科学领域的常用研究工具,自 20世纪 80年代聚合酶链式反应(PCR)问世以来[1],再到以后出现的核酸等温扩增技术、再生式序列复制和链置换扩增技术等以核酸检测为基础的分子生物学技术在医学和生物学领域、医学诊断和传染性疾病的检测得到了广泛应用[2]。但由于核酸的检测需要昂贵的仪器设备,存在特异性不高、操作程序复杂等特点,大大限制了作为快速诊断方法的应用。2000年Notomi等开发了一种新的核酸等温扩增方法,即环介导等温扩增法(1oop-mediated isothermal amp lification,LAMP)。其特点是在等温条件下即可高效、快速、高特异、高灵敏地扩增靶序列[3],使其作为快速诊断成为可能。它是针对靶基因的 6个区域设计 4种特异引物,利用一种链置换 DNA聚合酶(BstDNA polymerase)在等温条件(约 65℃)保温几十分钟,即可完成核酸扩增反应。不需要模板的热变性、长时间温度循环、繁琐的电泳、紫外观察等过程。基因的扩增和产物的检测可一步完成,扩增效率高,可在 15～60m in扩增 109～1010倍[4]。所有靶基因序列的检测可只通过扩增产物的有无来判别。该技术已经广泛应用于病毒、细菌、寄生虫等方面的检测。

1 环介导等温扩增技术的原理

1.1 引物设计

针对靶基因 6个特异序列(3′端的 F3c,F2c,F1c区以及 5′端的 Bl,B2,B 3区)设计 4条引物,即上游内部引物(FIP)、上游外部引物(F3)、下游内部引物(BIP)、下游外部引物(B3)[5]。后来添加了 2条环状引物,上游环状引物(LF)和下游环状引物(LB)。……