王慧玲 张晓霞 韩美艳 李婷婷 刘 伟

(1.郑州铁路职业技术学院，河南 郑州 450052;

2.郑州大学药学院，河南 郑州 450000)

桔梗(Platycodon grandiflorum A.DC)为桔梗科多年生草本植物，药用其根，春、秋二季采挖，洗净，除去须根，趁鲜剥去外皮或不去外皮，干燥。我国最早的一部药书《神农本草经》已有记载，系常用中药。桔梗性味苦、辛、平，归肺经，具有宣肺，利咽，祛痰，排脓之功效。用于咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛、音哑、肺痈吐脓、疮疡脓成不溃等症［1］。桔梗根中含有大量由果糖组成的桔梗聚糖，此外，桔梗中还含有大量的菊糖［2］。现代药理学研究发现桔梗多糖具有很好的抗肿瘤和增强机体免疫活性的作用［3－4］，而多糖的含量直接影响其药效的发挥，但是目前国内外对多糖含量的研究基本上测定的都只是总糖的含量而非总多糖的含量［5－6］。因此本文拟通过以桔梗为模型，研究简单且准确的多糖含量测定的方法，为以后桔梗多糖的进一步研究与应用提供参考和依据。

1 实验材料、试剂及仪器

1.1 实验材料

桔梗:产地是安徽亳州，经郑州大学生药系潘成学老师鉴定为Platycodon grandiflorum A.DC。

1.2 实验试剂

3，5－二硝基水杨酸(化学纯)，G －25(台州市路桥四甲生化塑料厂)，其他试剂均为国产分析纯。

1.3 实验仪器

旋转蒸发仪RE－52AA(上海亚荣生化仪器厂)，台式高速离心机TDL－5－A(上海安亭科学仪器厂)，分析天平AR1140(梅特勒－托利多仪器上海有限公司)，SHZ－D(Ⅲ)循环水式真空泵(巩义市予华仪器有限责任公司)，紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

2 方法与结果

2.1 桔梗多糖的提取

桔梗粉末→石油醚脱脂(60～90℃)→80%乙醇回流提取→热水浸提→趁热过滤→残渣重复提取三次→合并提取液→减压浓缩→Sevag法除蛋白(多糖浓缩液:氯仿:正丁醇=25:5:1)→无水乙醇沉淀(含醇量达80%)→静置过夜→抽滤→无水乙醇、丙酮、乙醚洗涤沉淀→桔梗多糖。

2.2 多糖换算因子的测定

精确称取干燥至恒重的桔梗精制多糖20mg，置于100ml容量瓶中，加蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得桔梗多糖贮备液。吸取0.4ml贮备液置25ml具塞试管中，按总糖标准曲线制作方法中“加蒸馏水至2ml”起操作。测定其吸光度，由回归方程求出此精制桔梗多糖贮备液中葡萄糖质量浓度，平行测定6次。按下式计算换算因子f:

f=W/(C×D)

式中:W为称取多糖的质量(mg)，C为精制桔梗多糖贮备液中葡萄糖质量浓度(mg/ml)，D为多糖的稀释倍数。测得f=1.3127。

2.3 桔梗多糖含量测定

2.3.1 总糖的含量测定

2.3.1.1 蒽酮试剂的配制

称取0.1g蒽酮，加入50ml浓硫酸搅拌溶解，放置暗处，此试剂需临用新配。

2.3.1.2 蒽酮硫酸法测总糖的标准曲线制作

称取105℃干燥至恒重的葡萄糖10mg，于100ml容量瓶中溶解并定容至刻度，即得到浓度为0.1mg/ml的标准葡萄糖溶液。

精密吸取0.1mg/ml的葡萄糖标准液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml分别置于干燥具塞试管中，分别加入蒸馏水至2ml，摇匀，于冰浴中小心自管壁加入蒽酮试剂5ml，加塞，混匀，保持混合物冷却，沸水浴中加热10min，取出冷却，以蒸馏水作空白(即0号管)，于620nm波长处测定吸光度，以浓度(μg/ml)为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线，得到回归方程为A=0.0126C+0.0064(R2=0.9994)。

2.3.1.3 桔梗总糖含量测定

称取干燥粗多糖10mg，加水溶解后转至100ml容量瓶中稀释至刻度。吸取0.8ml，置干燥具塞试管中，按照“2.3.1.2”中标准曲线绘制方法操作，平行测定3次，并按下式计算总糖含量(以葡萄糖计):总糖含量(%)=CD/W×100%。式中:C为样品溶液的葡萄糖的浓度(μg/ml)，D为样品溶液的稀释因子，W为称取的干燥粗多糖的重量(μg)，测得总糖含量为76.56%。

2.3.2 桔梗多糖中还原糖的含量测定

2.3.2.1 3，5 二硝基水杨酸法(DNS 法)

2.3.2.1.1 DNS 试剂的配制

将6.3g的3，5－二硝基水杨酸和262ml 2mol/L NaOH溶液加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g的苯酚和5g亚硫酸钠搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

2.3.2.1.2 DNS 法测还原糖的标准曲线绘制

称取105℃干燥至恒重的葡萄糖 100mg，于100ml容量瓶中溶解并定容至刻度，即得到浓度为1mg/ml的标准葡萄糖溶液。

精密吸取 1mg/ml的葡萄糖标准液 0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2ml分别置于 25ml具塞试管中，加蒸馏水使成2ml，摇匀，各加DNS试剂1.5ml摇匀，置沸水浴中加热5min，取出冷却至室温，用蒸馏水定容至25ml，加塞后摇匀，以蒸馏水作空白(即0号管)，于540nm波长处测定吸光度，以浓度(mg/ml)为横坐标，吸光度为纵坐标建立标准曲线。得到回归方程 A=0.988C －0.0191(R2=0.9998)。

2.3.2.1.3 DNS 法测样品还原糖含量

取干燥样品1g，加水溶解后转至100ml容量瓶中稀释至刻度。按“2.3.2.1.2”标准曲线制备项下的方法操作，平行测定3次。还原糖含量计算公式同“2.3.1.3”中总糖含量计算公式，测得还原糖含量为5.75%(以葡萄糖计)。

2.3.2.2 间接碘量法

2.3.2.2.1 碘量法测还原糖的标准曲线绘制

精密称取105℃下干燥至恒重的葡萄糖1g，溶解于水，在100ml容量瓶中稀释至刻度，得到10mg/ml的葡萄糖溶液。

分别精密量取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0ml的上述葡萄糖溶液至250ml碘量瓶中，补加水至50ml，各加入5ml I2溶液，15ml 0.1mol/L的NaOH溶液，摇匀，放置暗处15min，取出，加入4ml 0.5mol/L HCL摇匀。用0.1mol/L的Na2S2O3滴定至浅黄色，加入0.5%的淀粉指示剂，续滴至黄色消失。记录消耗的Na2S2O3体积。以空白与样品所耗硫代硫酸钠溶液毫升数之差为纵坐标，葡萄糖毫克数为横坐标作线性回归。得到回归方程为 y=0.1102x －0.2361(R2=1)。

2.3.2.2.2 碘量法测样品还原糖含量

取干燥样品2.5g，加水溶解后转至250ml容量瓶中稀释至刻度。取50ml样品液置250ml碘量瓶中，按标准曲线绘制的方法，自“各加入5ml I2溶液”起，依法测定，平行测定3次。以空白与样品液所耗的硫代硫酸钠溶液毫升数之差，带入葡萄糖回归方程中，计算相应的葡萄糖毫克数。测得还原糖含量为2.65%(以葡萄糖计)。

2.3.3 多糖的含量测定结果

2.3.3.1 DNS 法

多糖含量=(总糖含量－还原糖含量)×f×100%=70.81%

2.3.3.2 间接碘量法

多糖含量=(总糖含量－还原糖含量)×f×100%=73.91%2.4 验证实验

凝胶层析是一类利用有一定孔径范围的多孔凝胶的层析技术，根据小分子物质可以进入凝胶筛孔中，而大分子物质被排阻在其外的原理［5］，使不同分子量的物质可以分开。因此可应用凝胶层析法脱去粗多糖中的小分子糖类，从而使大分子多糖能与小分子糖分开。

2.4.1 上样与洗脱

取蓝色葡聚糖2000和β－环糊精各2mg上样。以蒸馏水洗脱，流速0.5ml/min，每10min收集一管，用蒽酮－硫酸法跟踪检测，以测出该凝胶柱的外水体积和小分子的洗脱体积。然后将多糖溶液上样，以蒸馏水洗脱，流速0.5ml/min。

2.4.2 含量测定

2.4.2.1 还原糖含量测定

合并小分子糖的洗脱液(以β－环糊精开始流出时收集)，精密吸取洗脱液2ml，按照DNS法测还原糖的标准曲线绘制方法操作，平行测定3次，测得还原糖的含量为2.72%(以葡萄糖计)。

2.4.2.2 总糖的含量测定

合并全部的洗脱液，精密吸取洗脱液1ml于10ml容量瓶中定容，然后吸取 0.6ml，按照“2.3.1.2”中标准曲线绘制方法操作，平行测定3次，测得总糖含量为73.82%(以葡萄糖计)。

2.4.2.3 多糖含量测定结果

多糖含量=(总糖含量－单糖含量)×f×100%=71.10%

通过葡聚糖凝胶层析法测得多糖的含量与前面三种方法测得的多糖含量基本一致。

3 讨论

苯酚－硫酸法和蒽酮－硫酸法测定的是样品中总糖的含量，不能排除还原性杂质(包括还原糖性的单糖)的干扰，因此本文用之于总糖的测定。苯酚－硫酸法中苯酚极易被空气氧化，这给重蒸馏带来困难，而且苯酚本身有毒，操作不便。蒽酮－硫酸法存在显色剂极易氧化而影响比色的问题，可通过现用现配的方法来解决。相比苯酚－硫酸法，蒽酮－硫酸法适用于少量样品测定，操作方便，本文选用后者。

间接碘量法在滴定的过程中，剩余碘会不可避免地挥发，导致滴定误差。同时，滴定要求在短时间内完成，加大了操作难度以及终点的判断延后。试剂昂贵也是此法的一个缺点。

DNS法试剂稳定性高，可在相对较长时间内使用，操作方便。

综合实验成本、设备、操作及影响测定因素等方面考虑，选用蒽酮－硫酸法与DNS法相结合测定桔梗多糖的含量。该法重复性好，灵敏度高，而且该法省去了过柱子的繁琐，节约了时间。

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典2005年版一部［Z］.北京:化学工业出版社，2005.

［2］吴梅青，刘佳佳.桔梗化学成分研究进展［J］.黑龙江医药，2007，20(5):443 －446.

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［4］Han S B，Park S H，Lee K H，et al.Polysaccharide isolated from the radix of Platycodon grandiflorum selectively activates B cellsand macrophagesbutnotT cells［J］.Int Immunopharmacol，2001，1(11):1969 －1978.

［5］张莲姬，南昌希，张丽霞.桔梗多糖的提取及其抗氧化作用研究［J］.食品与机械，2008，24(03):60 －63.

［6］李妍，魏建和，许旭东，等.苯酚硫酸法定量测定桔梗多糖的研究［J］.时珍国医国药杂志，2009，20(01):5 －7.

［7］杨安钢，毛积芳，等.生物化学与分子生物学实验技术［M］.北京:高等教育出版社，第一版，2002.