魏振满，丁晋彪，胡 琳，陈红鸽，吴荣荣，刘万卉，沙春洁

(1.中国人民解放军302医院临床药理室，北京 100039; 2.烟台大学药学院，山东 烟台 264005)

石杉碱甲是从天然植物千层塔中提取的生物碱，生物活性高，是一种对真性胆碱酯酶具有高度选择性的可逆性胆碱酯酶抑制剂，主要用于治疗良性记忆障碍及老年性痴呆[1]。将石杉碱甲制成缓释制剂，目的在于降低达峰血药浓度，延长达峰时间，减少患者的服药次数，减少不良反应，提高患者的依从性和生活质量，减轻患者家属的负担。笔者研究了石杉碱甲缓释片的生物利用度受饮食影响的程度，为临床用药提供参考。

1 仪器与试药

API 4000型三重四极杆串联质谱仪，配有离子喷雾离子化源以及Analyst 1.4.1数据处理软件(美国Applied Biosystem公司);Agilent 1100型高效液相色谱系统(美国Agilent公司)。石杉碱甲对照品(纯度大于99%，山东绿叶制药有限公司，批号为06020605);内标石杉碱乙(纯度大于99%，上海同田生物技术有限公司，批号为06103101;甲醇(色谱纯，Burdick＆Jackson公司)，其余试剂为分析纯;空白血浆由烟台市中心血站提供。

2 方法与结果

2.1 受试者选择

选择12名受试者，男女各半;年龄20～30岁，平均(23±3)岁;体重指数为19～24;无药物和食物过敏史，无心血管、呼吸、泌尿、消化道、内分泌、神经系统等病史;试验前2周内未服任何其他药物，3个月内未参加过药物临床试验和献血;无烟酒嗜好;体格检查及实验室检查(含血压、心率、呼吸频率、血常规、尿常规、肝功能、肾功能、心电图、胸片)无异常;了解试验的目的、药物性质、可能风险以及自己的权益，并自愿签署知情同意书。

2.2 给药方案与血样采集

本试验采用自身交叉试验设计。12名健康受试者随机进入空腹给药组和餐后给药组，6名受试者空腹给予石杉碱甲缓释片200 μg;另外6名受试者进食高脂、高蛋白食物，30 min后口服石杉碱甲缓释片200 μg。第1周期结束后，经过7 d的清洗期，两组受试者交换，进行第2周期试验。12例受试者均完成全部试验。受试者于试验前1天晚20:00点前入Ⅰ期临床试验病房，禁食不禁水约12 h;第2天早上8:00点左右服药，于服药前及服药后0.25，0.5，1，1.5，2，3，4，5，6，8，10，12，24，36，48 h 时从上肢肘静脉取血 4 mL，置肝素抗凝管中放置1 h，以3000 r/min离心10 min，分离血浆，置－70℃下冻存，备用。受试者服药及取血均在Ⅰ期临床试验病房进行，有主治医师在现场实施监护。

2.3 血药浓度测定

2.3.1 色谱与质谱条件

色谱柱:Agilent Plus－C18柱(100 mm ×3.0 mm，3.6μm);流动相:甲醇－水(80 ∶20，1 mmol/L 醋酸铵);流速:0.45 mL/min;柱温:35℃;进样量:10 μL。离子源:离子喷雾离子化源;离子喷射电压:5500 V;温度:550℃;源内气体1(GS1，N2)压力:50 psi;气体2(GS2，N2)压力:55 psi;气帘气体(N2)压力(CUR):15 psi;碰撞气(CAD):10 psi;正离子方式检测;扫描方式为多反应监测(MRM);石杉碱甲和石杉碱乙DP电压分别为82，94 V，CE电压分别为41，36 V，用于定量分析的离子反应分别为 m/z 243.4→m/z 210.1和m/z 257.5→ m/z 198.0。

2.3.2 血样处理

取200 μL血浆样品，置10 mL具塞离心管中，加入100 μL甲醇－水(80∶20)混合溶剂，加入100 μL内标溶液(20 ng/mL石杉碱乙)，100 μL 1 mol/L碳酸钠，涡流混合2 min，加入3 mL正己烷－二氯甲烷 －异丙醇(2∶1∶0.1)混合溶剂，涡流混合 7 min，离心10 min(3600 r/min)，取上层有机相，置另一试管中，36℃空气流下吹干，残留物加入 100 μL流动相(甲醇 －水，80∶20，1 mmol/L醋酸铵)溶解，涡流混合2 min，取10 μL进行测定。

2.3.3 方法学考察

专属性考察:分别取人空白血浆，按2.3.2项下方法操作，测得色谱图1 A;将一定质量浓度的石杉碱甲标准溶液和石杉碱乙溶液加入空白血浆中，同法操作，测得色谱图1 B;取受试者给药后收集的血浆样品，同法操作，测得色谱图2 C。结果表明，空白血浆中的内源性物质不干扰石杉碱甲和石杉碱乙的测定。

图1 高效液相色谱图

标准曲线绘制与定量下限确定:取人空白血浆200 μL，加入石杉碱甲标准系列溶液100 μL，配制成相当于含石杉碱甲血浆质量浓度为 0.0500，0.200，1.00，2.50，5.00，12.5 ng/mL 的样品，按2.3.2项下方法操作，进样10 μL，记录色谱图。以待测物质量浓度为横坐标(X)、待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标(Y)，用加权(W=1/x2)最小二乘法进行回归运算[2]，求得回归方程 Y=0.337 X+0.012，r=0.9985(n=6)。结果表明，石杉碱甲质量浓度线性范围为0.0500～12.5 ng/mL，血浆样品测定的定量下限为0.0500 ng/mL。

回收率试验:取空白血浆200 μL，按“标准曲线绘制与定量下限确定”项下方法制备低、中、高 3 个质量浓度(0.100，2.00，10.0 ng/mL)的样品，每一质量浓度进行6样本分析，残留物以流动相溶解，进样分析。同时，另取空白血浆200 μL，按2.3.2项下方法操作，36℃空气流下吹干，残留物加入相应质量浓度的标准溶液和内标溶液各100 μL，涡流混合，进样测定。低、中、高3个质量浓度样品的提取回收率分别为74.4%，68.7%，70.1%。

精密度与准确度试验:取空白血浆200 μL，按2.3.2项下方法配制低、中、高 3 个质量浓度(0.100，2.00，10.0 ng/mL)的质量控制样品，每一质量浓度进行6样本分析，连续测定3 d，根据当日的标准曲线计算样品的浓度、准确度与精密度。结果日内 RSD分别为7.5%，5.7%，4.7%(n=6);日间 RSD 分别为 9.0%，10.1%，2.9%(n=6)。

稳定性试验:按“标准曲线绘制与定量下限确定”项下方法制备低、中、高 3 个质量浓度(0.100，2.00，10.0 ng/mL)的样品，共6个样本，室温下放置24 h重新进样，结果所有样品的相对标准偏差均小于15%，表明样品在室温放置24 h的稳定性良好。取石杉碱甲标准溶液 0.100，2.00，10.0 ng/mL 各 100 μL，取 12 个样本，空气吹干后，加入200 μL空白血浆，其中6个样本作为对照，另外6个样本放于－35℃冰箱冷冻24 h，取出室温融化，再放入冰箱冷冻2 h，取出于室温融化后继续放入冰箱中冷冻2 h，再取出室温融化后，按2.3.2项下方法操作。结果所有样品的相对标准偏差均小于11.4%，表明血浆样品可以进行反复冻融，保障了整个分析过程中的数据真实、可靠。

2.3.4 未知血浆样本的测定和质量控制

按2.3.2项下方法操作，每批样品制备一条工作曲线，同时制备低、中、高 3 个质量浓度(0.10，2.00，10.00 ng/mL)的质量控制样品，每个质量浓度的质量控制样品进行双样本分析。根据每批的工作曲线计算质量控制样品和未知样品的质量浓度。上述质量控制样品中最多允许两个样品的质量浓度超出理论值的15%(低质量浓度点为20%)，否则此批数据不被接受。

2.4 血药浓度－时间曲线绘制

根据测得的血药浓度绘制药－时曲线，12名受试者空腹及进食后口服石杉碱甲缓释片平均血药浓度－时间曲线见图2。

图2 石杉碱甲平均血药浓度－时间曲线

2.5 药代动力学参数计算

采用DAS 2.0软件的统计矩模型计算受试者口服石杉碱甲缓释片后的药代动力学参数;采用梯形法计算药时曲线下面积(AUC)值，以半对数作图法，由消除相的末端4个浓度点计算半衰期(t1/2)，达峰浓度(Cmax)和达峰时间(tmax)采用实测值。药代动力学参数见表1。可见，12名受试者进食前后口服石杉碱甲缓释片主要药代动力学参数基本相似。

表1 12名受试者空腹和进食后口服石杉碱甲缓释片的药代动力学参数

2.6 生物利用度分析

根据 AUC0－t计算得到受试制剂的相对生物利用度平均为(97.5±10.8%)。空腹给药 Cmax的置信区间为进食后给药相应参数的76.6% ～87.6%(等效标准为70% ～143%)，说明 Cmax合格，没有显著性差异。tmax经非参检验得出 P＞0.05，说明 tmax没有显著性差异。

3 讨论

本研究采用多级离子选择性检测，减少了血样中杂质对色谱峰的干扰，定量限达到0.02 ng/mL，操作简便、快速、重现性好。因此，该法可用于大样本量的石杉碱甲血药浓度的检测及其药代动力学和生物利用度的研究。

本试验比较研究了石杉碱甲缓释片剂空腹及进食后体内石杉碱甲的药代动力学特征，主要药代动力学参数之间无显著性差异，与文献报道基本一致[3－4];采用随机双交叉试验设计的方差分析法进行分析，Cmax和 tmax经非参检验无显著性差异(P＞0.05)。尽管进食高脂肪、高蛋白食物不影响该药的 tmax和 Cmax，但进食后给药较空腹给药的 tmax和 Cmax有一定延后和增高，故推荐石杉碱甲缓释片剂饭前空腹服用。

[1]刘铁薇.石杉碱甲的药理作用与临床研究进展[J].中药材，2001，24(10):775－776.

[2]钟大放.以加权最小二乘法建立生物分析标准曲线的若干问题[J].药物分析杂志，1996，16(5):343 －346.

[3]王 勇，周彦彬，田 娟，等.HPLC/MS/MS法测定人血浆中石杉碱甲的浓度及人体相对生物利用度研究[J].中南药学，2009，7(8):583－586.

[4]霍 强，李见春，高 署，等.LC/MS/MS法测定人血清中石杉碱甲的浓度及应用[J].中国新药杂志，2009，18(11):1016－1026.