丁广洲 ，侯 静 ，马凤鸣

（1.中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨150080；2.黑龙江大学农作物研究院，哈尔滨150080；3.东北农业大学农学院，哈尔滨150030）

在高等植物氮代谢过程中，与NO3-还原有关的基因包括NR基因（nia）和NiR基因（nii）。高等植物的NR由nia编码。至今，nia或nia cDNA至少已在下列植物中被克隆：菠菜（Prosser&Lazarus，1990；Tamura等，1997；Kubo 等，1998）、笋瓜（Crawford 等，1986；Hyde 等，1991）、烟草（Cherel等，1990；Vaucheret等，1989；Yamamoto 等，2006）、 拟南芥 （Cheng 等，1988；Crawford 等，1988；Wilkinson&Crawford，1991,1993）、 水稻（Choi等，1989；Matsumoto 等，2005；Ohyanagi等，2006；Itoh 等，2007）、 大豆 （Wu 等，1995）、 玉米（Campbell等，1995；Katagi等，1999）、番茄（Daniel-Vedele 等，1989；王利群，2003）、桃（Nakamura 等，2001）、菜豆（Hoff等，1991；Jensen 等，1994，1996）、 大麦 （Miyazaki等，1991，Schnorr等，1991）、 马铃薯 （Harris 等，1997；Yamamoto 等，2003）、甘蓝型油菜（Fukuoka，1996）、蓖麻（Tsai等，2003）、矮牵牛（Salamoubat&Budang，1993）等。目前，还没有其他的关于甜菜硝酸还原酶基因全序列被克隆注册的报道。

1 材料与方法

1.1 供试品种

实验采用黑龙江省甜菜（Beta vulgaris L.）主栽二倍体纯系品种甜研7号（Ty7），原种由中国农科院甜菜研究所提供。种子在室温下浸种7h，置于培养皿中25℃恒温培养24～48h萌发，定植至营养钵中，置于光照培养箱中培养，待植株长到2～4对真叶时进行硝酸钾（30mmol/L KNO3）诱导处理，然后用于实验操作。

1.2 采用RACE技术克隆甜菜硝酸还原酶基因

取硝酸钾诱导后的甜菜叶片0.1 g，使用Trizol试剂盒（Invitrogen，USA）提取总RNA，电泳检测其质量，置-70℃保存。前期利用同源序列克隆技术筛选拼接得到一个1438bp NR基因片段。采用SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech，USA）进行5′端和3′端的RACE反应。根据中间片段设计基因特异性引物（GSP）（表 1）。 以 5′GSP 与 UPM 引物扩增基因的 5′端，反应程序为：5 个循环（94℃ 30 s，72℃ 3 min）；5个循环（94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min）；20 个循环（94℃ 30 s，58.7℃ 30 s，72℃ 3 min），4℃保存。 以 3′GSP与UPM引物扩增基因的3′端，反应程序为：5个循环（94℃ 30 s，72℃ 3 min）；5 个循环（94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min）；25 个循环 （94℃ 30 s，62℃30 s，72℃3 min），4℃保存。将PCR产物电泳条带切下，按照 TIAN gel Midi Purification Kit使用说明书回收PCR产物。将回收产物连接到pEASY-T1载体上，转化连接产物到Trans1-T1感受态细胞中。挑取白色单克隆培养，使用通用引物正反向引物（表1）鉴定阳性克隆。

表1 试验中采用的引物及序列

1.3 生物信息学分析

将选取的阳性克隆测序，根据测序结果拼接出基因的全长序列。应用NCBI的ORF finder软件对全长cDNA序列进行可读框架分析；利用BLAST P程序在NCBI网站通过同源性比对验证基因的完整性，并进行保守结构域分析；蛋白质等电点和分子量计算 http：//www.expasy.ch/cgi-bin/pi；利用DNASTAR中的EditSeq计算cDNA序列的GC含量；利用ClustalX 1.83和BOXSHADE 3.21在线软件（http：//www.ch.embnet.org/software/BOX_form.html）进行氨基酸序列相似性比对分析。

2 结果与讨论

采用RACE技术对前期研究获得的1438bp的中间片段进行全长序列克隆，3′RACE克隆获得了1109bp的序列；5′RACE克隆获得了803bp的序列，回收产物利用通用引物鉴定，显示克隆结果较好。使用 Contig Express软件将5′RACE序列、中间序列和3′RACE序列拼接，获得全长序列3247bp，找到了完整的ORF。甜菜Ty7 nia cDNA全序列共3247bp，含有一个2718bp的开放阅读框（ORF）；包括147bp的5′非翻译区（UTR）和382 bp的3′非翻译区。该序列编码905个氨基酸，分子量大小为102kD（ExPaSy的分子量分析），等电点为6.12。将全序列提交NCBI的GenBank注册，注册序列号为：EU163265。

2.1 基因的密码子偏好和编码产物氨基酸组成

在cDNA编码蛋白的氨基酸序列中，Gly含量最多为7.85%，其次为Glu 7.62%，第三为Val 7.29%，Cys含量最少为1.55%（见表2）。因此，甜菜硝酸还原酶基因编码氨基酸具有甘氨酸偏好。编码蛋白的氨基酸序列中含有14个Cys，说明编码产物中可能含有二硫键。现有的研究表明，植物NR蛋白C'端都具有二肽 （Cys-Gly）保守的基序。

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2.2 基因编码产物的功能预测

参照Daniel的方法，推测甜菜硝酸还原酶基因编码的氨基酸残基及其功能。表3是对该基因编码的氨基酸残基及其功能的分析。

从甜菜硝酸还原酶基因编码蛋白的结构域分析，从第93个氨基酸开始进入3个氧化还原中心的功能区（MoCo、Fe-血红素、FAD），其中 93～478为钼辅因子功能区（eukary NR Moco），含有386个氨基酸残基；535～608 为 Fe-血红素结合区（Cyt-b5），含 75个氨基酸；653～760为 FAD结合区（FAD binding 6）。 从 779～888 为 NADH 绑缚区（NADH binding 1）。 详见图 1。

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2.3 可能的酶水解位点和磷酸化位点

在连接3个氧化还原中心的两个绞链区中，绞链区I有3个可能被胰蛋白酶（trypsin）水解（hydrolysis）的精氨酸位点（-475、-510、-522）；两个可能被金黄葡萄球菌 V8 蛋白水解酶 （S.aureus V8 pro-tease）水解的谷氨酸位点（-487、-513）；另外含有4个容易被磷酸化的-Ser位点，（-502、-515、-525、-533）。绞链区Ⅱ也有 3 个可能被胰蛋白酶（trypsin）水解（hydrolysis）的精氨酸位点（-642、-649、-651）；一个可能被金黄葡萄球菌 V8 蛋白水解酶（S.aureus V8 pro-tease）水解的谷氨酸位点（-606）（见图 2）。

3 结论

克隆获得甜菜硝酸还原酶基因，该基因编码905个氨基酸，具有甘氨酸偏好，含有高等植物硝酸还原酶所特有的功能结构域：3个氧化还原中心的功能区（MoCo、Fe-血红素、FAD）。在连接3个氧化还原中心的两个绞链区中，分别具有若干可被胰蛋白酶水解的酶切位点和磷酸化位点。

[1]Crawford N M，H N Arst.The molecular genetics of nitrate assimilation in fungi and plants[J].Annu.Rev.Genet.， 1993，27：115-146.

[2]Crawford N M，Campbell W H，Davis R.Nitrate reductase from squash：cDNA cloning and nitrate regulation[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1986，83（21）：8073-8076.

[3]Melzer J M，A Kleinhofs and R L Warner.Nitrate reductase regulation：effects of nitrate and light on nitrate reductase mRNA accumulation[J].Molecular and General Genetics，1989，217（2－3）：341-346.

[4]Crawford N M.Nitrate：nutrient and signal for plant growth[J].Plant Cell，1995，7：859-868.

[5]Dawn E.Tucker，Damian J.Allen，Donald R.Ort.Control of nitrate reductase by circadian and diurnal rhythms in tomato[J].Planta，2004，219（2）：277-285.

[6]Vaucheret H，Vincenta M，Kronenberger J，et al.Molecular cloning and characterization of the two homeologous genes coding for nitrate reductase in tobacco[J].Mol.Gen.Genet.，1989，216（1）：10-15.

[7]Jensen P E，Hoff T，Moiler M G，et al.Identification and characterization of a nitrate reduetase gene from bean （Phaseolus vulgaris） contgxning four introns[J].Physiol.Plant.，1994，92：613-623.

[8]Hoff T，Stummann B M，Henningssen K W.Cloning and expression of gene encoding a root specific nitrate reductase in bean（Phaseolus vulgaris）[J].Physiol.Plant.，1991，82（2）：197-204.

[9]Prosser I M and Lazarus C M.Nucleotide sequence of a spinach nitrate reductase cDNA[J].Plant Mol.Biol.， 1990，15（1）：187-190.

[10]Tamura N，Takahashi H，Takeba G，et al.The nitrate reductase gene isolated from DNA of cultured spinach[J].Biochim.Biophys.Acta.，1997，1338（2）：151-155.

[11]Hyde G E，W H Campbell.Highlevel expression in Escherichia coli of the catalytically active flavin domain of com leaf NADH：nitrate reductase and its comparison to human NADH：cytochrome b5 reductase[J].Biochem.Biophys.Res.Commun.，1990，168（3）：1285-1291.

[12]Cherel I，Gonneau M，Meyer C，et al.Biochemical and immunological characterization of nitrate reduetese-defieient nia mutants of Nicotiana plumbaginifolia[J].Plant Physiol.，1990，92（3）：659-665.

[13]Yamamoto-Katou A，Katou S，Yoshioka H，et al.Nitrate reductase is responsible for elicitin-induced nitric oxide production in Nicotiana benthamiana[J].Plant Cell Physiol.，2006，47（6）：726-735.

[14]Cheng C L，G N Acedo，J Dewdney，et al.Differential expression of the two Arabidopsis nitrate reductase genes[J].Plant Physiol.，1991，96（1）：275-279.

[15]Wilkinson J Q and Crawford N M.Identification and characterization of a chlorate-resistant mutant of Arabidopsis thaliana with mutations in both nitrate reductase[J].Mol.Gen.Genet.，1993，239 （1-2）：289-297.

[16]Choi H，Kieinhofs A，An G.Nucleotide sequence of rice nitrate reductase genes[J].Plant Mol.Biol.，1989，13（6）：731-733.

[17]Wu S，Lu Q，Kriz A L and Harper J E.Identification of cDNA clones corresponding to two inducible nitrate reductase genes in soybean：analysis in wild-type and nr1 mutant[J].Plant Mol.Biol.，1995，29 （3）：491-506.

[18]Daniel-Vedele F，Dorbe M F，Caboche M，et al.Cloning and analysis of the tomato nitrate reductase-encoding gene:protein domain structure and amino acid homologies in higher plants[J].Gene.，1989，85（2）：371-380.

[19]Jensen P E，Hoff T，Stummann B M，et al.Functional analysis of two bean nitrate reductase promoters in transgenic tobacco[J].Physiol.Plant.，1996，96（3）：357-358.

[20]Miyazaki J，Juricek M，Angelis K，et al.Characterrization and sequence of a novel nitrate reductase from barley[J].Mol.Gen.Genet.，1991，228（3）：329-334.

[21]Schnorr K M，Juricek M，Huang C，et al.Analysis of barley nitrate reductase cDNA and genomic coones[J].Mol.Gen.Genet.，1991，227（3）：411-416.

[22]Fukuoka H，Ogawa T，Minami H，et al.Developmental stage-specific and nitrate independent regulation of nitrate reductase gene expression in rapeseed[J].Plant Physiol.，1996，111（1）：39-47.

[23]Tsai CB，Kaiser WM，Kaldenhoff R.Molecular cloning and characterization of nitrate reductase from Ricinus communis L.heterologously expressed in Pichia pastoris[J].Planta.，2003，217（6）：962-700.

[24]Fei-Fei Sun，Xi-Lin Hou，Ying Li，Xue-Dong Yang.Molecular cloning and characterization of nitrate reductase gene from nonheading Chinese cabbage[J].Scientia Horticulturae.，2008，119（1）：1-10.

[25]Thomas Hettmann，Roman A.Siddiqui，Christa Frey et al.Mutagenesis study on amino acids around the molybdenum centre of the periplasmic nitrate reductase from Ralstonia eutropha[J].Biochemical and Biophysical Research Communications.，2004，320（4）：1211-1219.

[26]王利群，王勇，董英，等.硝酸盐对硝酸还原酶活性的诱导及硝酸还原酶基因的克隆[J].生物工程学报，2003，19（5）：632-635.

[27]Mesnard F，Ratcliffe R G.NMR analysis of plant nitrogen metabolism[J].Photosynthesis Research.，2005，83（2）：163-180.

[28]Jie Li，Lexun Xue，Hongxia Yan，et al.The nitrate reductase gene-switch：A system for regulated expression in transformed cells of Dunaliella salina[J].Gene.，2007，403（15）：132-142.