房 斌，蒋林时

(辽宁石油化工大学环境与生物工程学院，辽宁 抚顺 113001)

汽油是重要的石油制品，主要由C4～C10烷烃组成，其中异辛烷是其主要成分[1]。汽油在使用过程中会不可避免地发生泄漏和废弃，造成环境污染，也会通过呼吸、皮肤接触、饮食摄入等途径损伤人体[2，3]。环境中汽油的降解是混合菌共同作用的结果，通常不同的降解菌降解不同类型的烃分子[4]。

作者在此从石油污染土壤中筛选、分离纯化得到一株能以异辛烷为唯一碳源的菌株，并对其生理生化特性及降解条件进行研究，以期为混合菌株应用于石油污染的微生物修复奠定基础。

1 实验

1.1 菌种与培养基

菌种筛选自大庆油田某采油井井台周围被石油污染的土壤。

富集培养基(g·L-1)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，pH值7.0。

无机盐培养基(g·L-1)：NaNO30.5，NaH2PO41.0，无水CaCl20.1，MgSO4·7H2O 0.2，(NH4)2SO40.5，KH2PO41.0，pH值7.0。

固体培养基[5，6]：各培养基中加入2%(质量浓度)琼脂，pH值7.0。

1.2 方法

1.2.1 菌株的驯化与筛选

取土样适量，接种于100 mL含500 mg·L-1异辛烷的富集培养基中，于35℃、200 r·min-1摇床培养。按10%(体积分数，下同)的接种量2 d接种1次，使异辛烷浓度逐渐增至1000 mg·L-1、1500 mg·L-1和2000 mg·L-1。然后用以2000 mg·L-1异辛烷为唯一碳源的无机盐培养基驯化培养4 d。用稀释平板法将菌液涂布到含500 mg·L-1异辛烷的无机盐培养基平板上，驯化培养5～7 d，挑取生长良好的单菌落，在富集培养基平板上反复划线纯化3次，接种于无机盐试管斜面中，待生长良好置于4℃冰箱保存，备用[7]。

观察记录菌株生长情况、菌落特征、菌体形态结构、染色反应及生理生化反应，依据《伯杰氏细菌鉴定手册》对其进行鉴定[8，9]。

1.2.2 异辛烷降解率的测定

将菌株活化液置于含500 mg·L-1异辛烷的无机盐培养基中，于35℃、200 r·min-1培养72 h，将培养液离心分离(20 min，3000 r·min-1)，取上清液加入0.5%(以样液体积计)浓硫酸，用20 mL石油醚萃取3次，收集上层清液用无水硫酸钠脱水，过滤，定容。用紫外分光光度计测定异辛烷残留量(以吸光度值A217表示)[10，11]，并计算异辛烷的降解率。

1.2.3 菌株生长量的测定

菌株生长量的测定采用光电比浊法[12]。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选分离及鉴定

经过反复驯化、富集培养、划线分离与纯化，筛选到一株具有降解异辛烷能力的菌株，命名为LSH01。

菌落的形态特征：表面粗糙，呈规则线形，扁平，乳白色不透明，挑取时有粘性。镜检显示：菌细胞为长杆状，菌体呈紫色，属革兰氏阳性细菌。生理生化特性：氧化酶阳性，吲哚反应阴性，氧化葡萄糖产酸不产气，接触酶阳性，V.P反应阳性，M.R反应阳性，分解含硫氨基酸产硫化氢，产氨实验阳性，不利用柠檬酸，不水解淀粉，液化明胶，牛奶胨化，还原硝酸盐。

依据Bergey分类系统(1994)芽孢杆菌属的基本特征，初步鉴定菌株LSH01为芽孢杆菌属(Bacillus)。

2.2 菌株LSH01的生长曲线

将菌株LSH01按10%接种量接种于含500 mg·L-1异辛烷的富集培养基中，于35℃、200 r·min-1摇床培养，定时取样测定OD600，绘制菌株的生长曲线，结果见图1。

图1 菌株LSH01的生长曲线

由图1可知，接种0～10 h，菌株生长量无显著增加，为延滞期；10～27 h，菌株生长量快速上升，为对数生长期；27～46 h，为稳定生长期；46 h后菌株进入衰亡期。由此可见，菌株LSH01繁殖速度较快、繁殖能力较强、对数生长期较长，对实际应用较有利。

2.3 温度对菌株LSH01生长和异辛烷降解的影响

菌株LSH01按接种量10%接种，于200 r·min-1、不同温度下摇床培养72 h，测定异辛烷降解率和菌株生长量，结果见图2。

图2 温度对菌株LSH01生长和异辛烷降解的影响

由图2可知，温度为35℃时菌株生长量和异辛烷降解率最高。这可能是因为，微生物产生的酶有最适温度，温度较低时，酶活性受到影响，代谢活性差，微生物生长缓慢，导致异辛烷降解效果下降；温度较高时，蛋白质遭到破坏或凝固，菌株生长受阻，甚至死亡，也导致异辛烷降解效果下降。因此，确定最适温度为35℃。

2.4 pH值对菌株LSH01生长及异辛烷降解的影响

菌株LSH01按接种量10%接种，于35℃、200 r·min-1摇床培养72 h，考察pH值对异辛烷降解和菌株生长的影响，结果见图3。

图3 pH值对菌株LSH01生长和异辛烷降解的影响

由图3可知，pH值为6.0～8.0时，菌株生长良好，pH值为8.0时生长量最高；pH值为4.0～8.0时，随着pH值的增大异辛烷降解率逐渐升高，pH值为8.0时降解率达到最大值，此后又逐渐下降。因此，确定最适pH值为8.0。

2.5 异辛烷浓度对菌株LSH01生长及异辛烷降解的影响

菌株LSH01按接种量10%接种，于35℃、200 r·min-1摇床培养72 h，考察异辛烷浓度对异辛烷降解和菌株生长的影响，结果见图4。

图4 异辛烷浓度对菌株LSH01生长和异辛烷降解的影响

由图4可知，异辛烷浓度为500 mg·L-1时，菌株生长量最高；异辛烷降解率随着异辛烷浓度的增大逐渐下降。因此，确定最适异辛烷浓度为500 mg·L-1。

2.6 接种量对菌株LSH01生长及异辛烷降解的影响

在35℃、200 r·min-1摇床培养72 h条件下，考察接种量对异辛烷降解和菌株LSH01生长的影响，结果见图5。

图5 接种量对菌株LSH01生长和异辛烷降解的影响

由图5可知，异辛烷降解率和菌株生长量随接种量的增大而升高，但接种量超过15%时，菌株生长量显著下降。这是因为，随着接种量的增大，营养物消耗较快，代谢产物积累，菌株生长后期的营养匮乏，生物量减少，从而使菌株生长量下降，降解率趋于平缓。因此，确定最适接种量为15%，此时异辛烷降解率为74.9%。

3 结论

通过富集培养的方法从土壤中分离得到一株能以异辛烷为唯一碳源的菌株LSH01，经形态特征及生理生化特征鉴定，初步确定为芽孢杆菌属(Bacillus)。其最适生长温度为35℃、最适pH值为8.0，在接种量为15%时，500 mg·L-1异辛烷降解72 h的降解率为74.9%。

[1] 董仕宝，胡利明.油品知识漫谈—汽油篇[J].石油知识，2009，17(3)：53-54.

[2] 任磊，黄廷林.土壤的石油污染[J].农业环境保护，2000，19(6)：360-363.

[3] Water W，Kovalick J R. Trends in implementing innovative technologies in the USA[J].Contaminated Soil，1993，12(3)：201-206.

[4] 金文标，宋莉晖，董晓利，等.油污土壤微生物治理的影响因素[J].环境保护，1998，(10)：27-28.

[5] 诸葛健，沈微.工业微生物育种学[M].北京：化学工业出版社，2006：55-62.

[6] 王兰，王忠.环境微生物学实验方法与技术[M].北京：化学工业出版社，2009：45-46.

[7] 陈亚丽，张先恩，刘虹，等.甲基对硫磷降解菌假单胞菌WBC-3的筛选及其降解性能的研究[J].微生物学报，2002，42(4)：490-497.

[8] 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M].北京：科学出版社，2001：128-132.

[9] 布坎南R E，吉本斯N E，著，中国科学院微生物研究所，译.伯杰氏细菌鉴定手册(第八版)[M].北京：科学出版社，1998：117-119.

[10] 国家环境保护总局.水和废水监测分析方法(第四版)[M].北京：中国环境科学出版社，2002：96-97.

[11] 谢重阁.环境中石油污染物的分析技术[M].北京：中国环境科学出版社，1987：82-83.

[12] 沈萍，范秀荣，李广武.微生物学实验(第三版)[M].北京：高等教育出版社，1999：97-99.