许龙岩 袁慕云 凌莉 黄华军 邹志飞

(广东出入境检验检疫局 广东广州 510623)

1 前言

经典的副溶血性弧菌(Vibrio Parahemolyticus，VP)分离培养和鉴定需要1－2周时间，人力物力花费大，不适应实际检验工作的需要。随着分子生物学技术的发展，分子水平上的分型与诊断方法以其敏感性高、特异性强、分型率和分辨率佳的优点，逐渐取代了传统的表型分型技术，在微生物的分型与诊断中发挥巨大的作用［1］。DiversiLab系统(DVL)是以基因外重复回文序列－PCR(Repetitive Extragenic Palindromic－ PCR，REP－PCR)技术为原理的自动化分子分型系统，已应用于原核和真核微生物的分子分型，包括具有重要流行病学意义的微生物如不动杆菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌和曲霉［2］。本研究用DVL系统对近几年从食品中分离的21株VP进行REP－PCR分子分型，掌握其在食品中的分子型别，并与PFGE结果相比较，探讨其对VP的分型能力，为VP的快速分型和溯源提供技术基础。

2 材料与方法

2.1 材料

2.1.1 试验菌株

食品中分离的VP 21株，为本实验室和中国检验检疫科学研究院食品所保存菌株，均用API 20E和VITEK2确认为VP，菌株信息见表1。PFGE分子量标准沙门氏菌H9812为本实验室保存菌株。

2.1.2 主要仪器和试剂

DVL系统、REP－PCR试剂盒及微流体芯片：法国梅里埃公司;

PTC－200型PCR仪、CHEF MAPPER脉冲场电泳仪、Gel Doc XR凝胶成像系统：美国Biorad公司;

一次性血琼脂平板：广州环凯公司。

2.2 方法

2.2.1 DNA 提取

用接种环刮取血平板上分离纯化的VP菌落，使用REP－PCR配套核酸提取试剂盒，按照厂家说明书推荐步骤提取 DNA，DNA浓度控制在25－50ng/uL。

2.2.2 REP －PCR 分型

以提取的VP DNA为模版，使用DVL配套的REP－PCR试剂盒进行PCR扩增，PCR循环参数为：94℃ 2min，94℃30s，50℃30s，70℃90s，35 个循环，70℃ 3min，反应体积为25uL。……