廖丽晶 金 崑

(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所，北京，100091)

胡慧建 张于光 张 亮

(华南濒危动物研究所)(中国林业科学研究院森林生态环境与保护研究所)(华南濒危动物研究所)

亚洲黑熊(Ursus thibetanus)也称黑熊，隶属食肉目熊科(Ursidae)，生活在潮湿的丛林地区，是亚热带常绿阔叶林的典型物种，主要分布于俄罗斯与亚洲的印度、尼泊尔、日本、朝鲜、阿富汗和中国。目前亚洲黑熊已经被列入《濒危野生动植物种国际贸易公约》附录Ⅱ，为《中国濒危动物红皮书》易危种，是我国二级重点保护动物。在我国分布有5个地理亚种，即指名亚种(西藏黑熊)(S.t.thibetanus)、长毛亚种(喜峰黑熊)(S.t.laniger)、四川亚种(S.t.mupinensis)、台湾亚种(S.t.formosanus)和东北亚种(S.t.ussuricus)［1－2］。根据各地县志所记，上个世纪50年代以前，亚洲黑熊在广东分布很广泛，从粤北山区到南海之滨，从粤东到粤西都有黑熊的分布［3］。广东车八岭国家级自然保护区位于广东省北部始兴县境内，地理位置为东经 114°07'39″～ 114°16'46″，北纬 24°40'29″～24°46'21″，东面与江西省全南县接壤，是南岭南缘保存较完整、面积较大、分布较集中、原生性较强的具有代表性的中亚热带常绿阔叶林。1926年始兴县县志中有黑熊的记载，说明车八岭地区当时还有黑熊分布。但是1992—1994年进行的广东黑熊资源专项调查以及后来的野生动物资源调查中，发现广东黑熊仅分布于粤北山地林区的乳源、阳山、连县、曲江、英德、乐昌6个县市的范围内［3］。本研究通过分子鉴定确定车八岭保护区发现的爪鞘来自亚洲黑熊，为近20 a来首次在该地区发现亚洲黑熊存在的痕迹，表明该地区森林生态环境不断改善，亚洲黑熊的种群正在恢复。

1 材料与方法

材料 爪鞘来自于车八岭国家级自然保护区内的仙人洞村附近山脊，是2010年4月23日华南濒危动物研究所在开展国家林业局调查试点项目时所发现。因难以把握爪鞘特征，且在传统的外形对比情况下，无法确定其物种，故采用分子鉴定方法进行鉴别。

试剂 DNA IQTM系统试剂盒、蛋白酶K和DTT来自Promega公司;QIAquick凝胶回收试剂盒来自Qiagen公司;Taq DNA聚合酶、dNTP来自天根公司;常规试剂为国产分析纯。

爪鞘DNA提取 内壁刮取适量爪鞘(5.0 mg)置2.0 mL离心管，加入1.5 mL 10%SDS浸泡30 min，去离子，水冲洗3～5次，确保表面粘附的细胞完全去除。然后加入200 μL DNA IQTM系统裂解液、20 μL 10 g/L 蛋白酶 K、20 μL 1 mol/L DTT，56℃水浴9 h，待裂解完全，95℃灭活10 min。套管离心后取上清液，按DNA IQTM系统试剂盒操作手册提取模板DNA，并溶解于50 μL洗脱液中。

PCR扩增和测序 选择食肉目线粒体Cyt b基因的特异性引物进行物种鉴定，引物对为CAT－CytB－F:5'－AAACTGCAGCCCCTCAGAATGATTTGTCCTCA－3'和CAT－CytB－R:5'－TATTCTTTATCTGCCTATACATRCACG － 3'［4］。该引物目的片段大小为105～108 bp。PCR反应体积为30 μL，体系中含有0.5 mmol/L 的 dNTPs、1.5 × PCR buffer、0.5 U 的 Taq 酶、1 μg的BSA、0.72 mmol/L的引物和2 μL模板 DNA。PCR 反应条件为94℃预变性2 min，94℃变性15 s，50℃退火30 s，72℃延伸1 min，35个循环，最后72℃延伸2 min。扩增产物通过1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，目的片段经QIAquick凝胶回收试剂盒纯化后送华大基因生物工程技术服务有限公司进行测序。

物种鉴定和数据分析 通过MEGA 4.0软件进行线粒体DNA序列分析，去掉引物序列，得到目的片段序列。利用Genbank中的BLAST在数据库中找到的参照序列进行比对，根据已有的研究，比对的结果与数据库中的已知序列同源性在97%以上时，确定与该序列的物种为相同种。

2 结果与分析

爪鞘DNA提取物及PCR扩增产物电泳图谱如图1所示。从爪鞘中提取的DNA，大小可达到400 bp以上，因为角化组织中提取出的DNA都会存在严重降解，因此电泳图谱上出现弥散现象。阴性对照(泳道4和泳道6)和空白对照(泳道3)未显示出条带，说明提取过程和扩增过程中未受到污染。扩增产物大小在150 bp左右(泳道1和泳道2)，符合目的片段大小。

图1 爪鞘DNA和线粒体Cyt b扩增电泳图谱

测序结果通过MEGA 4.0软件分析，去掉两侧引物序列，得到长度为108 bp的目的片段，序列为5'－TAGGACGGGGCTTGTATTATGGCTCATACCTACTCTCAGAAACATGAAACATTGGCATCATCCTCCTACTTACAGTTATAGCCACCGCATTCATAGGATACGTCCTAC－3'。通过BLAST软件将它与Genbank数据库已有序列进行比对，发现它与数据库中亚洲黑熊的Cyt b基因具有最好的相似性，其同源性为97.2% ～99.1%，相似度最高的是序列号为AB360957.1的亚洲黑熊线粒体Cyt b基因序列，序列一致性达到99.1%(图2)。其次是美洲黑熊(Ursus americanus)，同源性在92% ～96%，最高达到95.4%，懒熊(Melursus ursinus)为85% ～91%。已有的研究表明，该序列可以用于食肉目动物物种间鉴定，在同一物种内的序列差异为 0 ～0.03，物种间的最小差异为 0.04［4，6－7］，由此可确定该爪鞘来自亚洲黑熊。亚洲黑熊在我国分布有5个地理亚种，广东车八岭地区为四川亚种(S.t.mupinensis)分布区域［1］，因此该爪鞘鉴定为亚洲黑熊四川亚种(S.t.mupinensis)。

3 结论与讨论

爪鞘角化细胞内的富含二硫键的角蛋白不易被破坏，同时细胞核已经退化转移，只有线粒体尚未完全退化转移，给DNA提取造成一定的困难。本研究采用DNA IQTM系统裂解液、DTT以及蛋白酶K联合消化的方法提取爪鞘DNA，加入DTT有助于打开角蛋白结构中的二硫键，破坏细胞间连接和核膜，提高消化效率［8］。DNA IQTM系统采用顺磁性树脂吸附DNA，在磁场中可以彻底去除残液，小片段DNA丢失较少，纯化效率大大提高。

图2 序列比对结果

目前常用的动物物种鉴定方法有形态鉴定法、显微镜镜检法、理化检验法以及DNA分析技术等。形态鉴定法是最常用也是最基础的鉴定方法，可以对活体或者比较完整的尸体、毛皮或骨骼以及具有很特殊性状的检材做出较为准确的鉴定，由于微观形态在物种内存在的差异性和复杂性，给显微镜镜检法的结果带来了不确定性。而理化检验检测物质的特定成分或者广谱成分，需要大量的实验工作才能确定其标准范围，为最终确定结论带来了较大的风险或偏差［9］。DNA是生物的遗传信息载体，分析结果不受样品形态(无论原品、粉状或片状)和材料来源的影响，具有重复性好、灵敏度高等优点，而且随着分子生物学技术的发展，DNA序列数据库也呈几何数增长，可为物种鉴定提供丰富的可比较的数据库，使鉴定结果更具科学性和可靠性［10］。本试验所采用的引物曾经成功地用于南美洲肉食动物粪便样品鉴定［4］，研究表明，该引物同样可以用于亚洲的雪豹、赤狐、狼和猞猁等物种鉴定［6－7］。本研究中测序结果与Genbank中其他的亚洲黑熊的序列相似度都在97.2% ～99.1%范围内，与美洲黑熊的序列相似度最高在 95.4%，与 Farrell和张于光等［4，6－7］的研究结果相符，该序列在同一物种内的序列差异为0～0.03，物种间的最小差异为0.04，说明该引物也适用于黑熊样品的物种鉴定。

1992—1994年进行的广东黑熊资源专项调查以及后来的野生动物资源调查中，车八岭地区未发现亚洲黑熊存在的痕迹。本研究通过对车八岭保护区发现的爪鞘进行物种鉴定的结果表明，在车八岭地区存在亚洲黑熊。同时有研究表明，通过20多年的保护实践，车八岭保护区生物多样性日渐丰富，动植物种类日渐增多，鸟类从过去的170种增加到目前的223种，其他各种野生动植物种群数量也不断增多［11］。黑熊的适应能力较强，生态幅较宽，只要有基本的生存条件和繁殖环境，其自然种群的恢复就比较容易。由此可见，可能是因为车八岭地区森林生态环境建设不断加强，引起南岭地区黑熊种群的扩散，使车八岭地区亚洲黑熊的种群正在恢复。

虽然南岭南缘的黑熊种群目前正在恢复，但对于南岭地区黑熊资源的近况、分布、数量以及生境的变化等都不太清楚。距离上一次广东黑熊资源专项调查已有10多年，有必要对广东的黑熊资源进行一次全面的调查，尤其是针对黑熊主要分布的南岭地区，掌握该地区黑熊种群数量与分布，了解黑熊栖息环境的状况和变化，对全省的黑熊资源做出比较客观的评估，以便及时采取相应的保护对策。以往的资源调查采用的通常是组建调查队伍、访问调查、现场调查及查阅有关的文献综合评估的方法。现场调查又以黑熊活动的踪迹，调查黑熊栖息地的自然生态环境、食物的丰富程度及组成为主，像大型猫科、熊科动物，这种数量较少、不均匀分布、隐蔽性强的类群，给种群数量以及种群遗传结构调查造成了很大困难。近年来分子生物学的发展，尤其是粪便DNA分析技术的发展为这些动物类群的调查带来了福音，通过对粪便、毛发DNA中多种遗传标记的识别，研究者可以对它们的种群数量、领域边界划定、生活史、种群遗传结构和遗传多样性等方面进行研究［12－13］。同时，对于这些隐蔽性强的动物，粪样的系统收集将比利用单一的直接数量调查来评估种群数量更加准确，而且能够节省大量的人力、物力和财力［14］。

对车八岭地区发现的爪鞘进行分子鉴定，证实了目前车八岭国家级自然保护区存在黑熊。但是目前该地区黑熊的种群数量和分布的情况，是否为南岭地区黑熊种群扩散的结果，南岭地区黑熊资源近况如何都不太清楚，需要进一步对南岭地区进行系统的粪便、毛发等活动痕迹的收集，运用一系列的不同性质的分子标记，对该地区的黑熊种群数量和分布展开详细调查。

［1］汪松.中国动物濒危红皮书:哺乳类［M］.北京:科学出版社，1998.

［2］马逸清，徐利，胡锦矗.中国熊类资源数量估计及保护对策［J］.生命科学研究，1998，2(3):205.

［3］张春兰，卢学理，袁喜才.广东省黑熊资源及保护对策［J］.野生动物杂志，2007，28(4):44 －46.

［4］Farrell L E，Roman J，Sunquist M E.Dietary separation of sympatric carnivores identified by molecular analysis of scats［J］.M ol Ecol，2000，9:1583 －1590.

［5］程冲，杨颖峰，孙琳琳，等.用磁珠法快速提取指甲DNA［J］.中国法医学杂志，2009，24(3):197 －198.

［6］Janecˇka J E，Jackson R，Zhang Yuqiang，et al.Population monitoring of snow leopards using noninvasive collection of scat samples:a pilot study［J］.Animal Conservation，2008，11(5):401 － 411.

［7］张于光，Janecka J E，李迪强，等.基于粪便DNA的雪豹种群调查和遗传多样性研究［J］.动物学报，2008，54(5):762 －766.

［8］薛小琦，莫耀南.腐败及角化组织的DNA提取及mtDNA(CA)n重复子分型［J］.河南科技大学学报:医学版，2005，23(4):248－249.

［9］周用武，杨玉华.动物物种鉴定的非DNA方法评述［J］.通化师范学院学报，2009，30(10):58－61 .

［10］周用武.DNA技术鉴定动物物种研究评述［J］.通化师范学院学报，2008，29(2):48 －51.

［11］饶纪腾，宋相金，肖荣高.车八岭自然博物馆在保护区建设中地位和作用的研究［M］.广州:岭南美术出版社，2004.

［12］吴明，张恩迪.粪便学在有蹄类动物数量调查研究中的应用与展望［J］.四川动物，2005，24(2):226 －229.

［13］王戎疆.粪便DNA分析技术在动物生态学中的应用［J］.动物学报，2001，47(6):699 －703.

［14］魏辅文，绕刚，李明，等.分子粪便学及其应用:可靠性、局限性和展望［J］.兽类学报，2001，21(2):143－152.