陈朝婷，高峰，陆平，蔡文玮，盛净

(1.上海交通大学医学院附属第九人民医院老年病科，上海 200011;2.上海交通大学微纳科学技术研究院，上海 200240)

目前国内外对经皮腔内冠状动脉成形术(percutaneous transluminal coronary angioplasty，PTCA)后再狭窄的基因治疗研究已取得一定进展:通过合适的基因载体转染内皮型一氧化氮合酶(eNOS)基因可以促进一氧化氮(nitric oxide，NO)合成及分泌，抑制损伤后血管平滑肌细胞增生，调控再狭窄的关键环节［1-3］。以往实验已证实了腺病毒载体基因转染的高效性［4-5］，但其自我复制性和免疫原性限制其进一步向临床应用转化［6-7］。本研究采用有良好生物兼容性、低免疫源性、可重复性及磁场靶向性等特点的壳聚糖纳米磁性粒子耦合eNOS基因在外加磁场下进行体外转染，并与腺病毒载体比较转染可行性，以期为基因防治再狭窄的安全性和靶向性作进一步探索。

1 材料与方法

1.1 主要化学试剂和仪器

化学试剂:FeCl3·6H2O、FeCl2·4H2O、氨水(上海化学试剂公司);壳聚糖(90%脱乙酰基，上海生工)，18 MΩ·cm去离子水自制。原核表达载体 Puc13-eNOS(美国 Massachusetts General Hospital的 Bloch医师惠赠)，高效真核表达载体pcDNA3.1(-)(Inviotrogen)，重组腺病毒eNOS质粒(AdCMV-eNOS)及pcDNA3.1-eNOS均由本实验室构建［8-9］。Dulbecco改良基础培养基(DMEM，Gibco BRL)，α-actin(DOKO)，RT-PCR试剂盒(Takara)，Trizol(Gibco BRL)。dNTP(Pharmacia)，DMSO(Amresco)，RT-PCR Kits(TaKaRa，Japanese)，兔抗人NOS3多克隆抗体(Santa Cruz)，鼠抗兔FITC(DAKO)。其余化学试剂都是分析纯或国内分装。

仪器:透射电子显微镜(JEM-2010，JEOL Ltd.，Japan);傅立叶-红外光谱仪(FT-IR，EQUINOX 55，BRUKER Ltd，German);热重分析仪(TGA 7，Perkin Elmer，Inc.，USA);电泳仪(Hoeter，USA)，GIS-2800 凝胶图像处理系统(上海天能科技有限公司);紫外分光光度计(BECKMAN DU-600，USA)，PCR 仪(Biometer，Germany)，倒置显微镜(Olympus，Japan)，生物显微镜(Nikon，Japan)，PCR 扩增仪(Genius，USA)，CO2培养箱(Napco，USA)，低温高速离心机(Beckman，USA)，核酸分析仪(Beckman，USA)。

1.2 方法

1.2.1 磁性壳聚糖(简称磁聚糖)纳米eNOS基因载体的制备 由上海交通大学微纳技术研究院制备提供:原位共沉淀法制备磁聚糖纳米粒子，包被eNOS质粒，制备得 pH=5、包封率为82.4%、质量比为4∶1的磁聚糖-eNOS耦合体。

1.2.2 血管损伤后平滑肌细胞培养和鉴定 建立SD大鼠颈总动脉球囊损伤术后模型［8］，分别取受损侧和对侧正常颈总动脉组织块培养平滑肌细胞，用含10%FCS的Dulbecco改良基础培养基(DMEM，Gibco BRL公司)培养，并以α-actin进行免疫化学鉴定和比较。

图2 平滑肌细胞α-actin免疫染色鉴定

1.2.3 MTT法检测不同浓度磁聚糖对平滑肌细胞的毒副作用 用0.25%的胰蛋白酶消化平滑肌细胞制成2×105个·ml－1的单细胞悬液，接种于96孔板，每孔接种200 μl，空白对照孔中只加入细胞培养基不加细胞，待生长24 h 细胞贴壁后，分别加入0、10、20、40、80、100、120 mg·ml－1不同浓度的磁聚糖纳米颗粒，各浓度设5个平行孔。置于37℃、5%CO2培养箱中，细胞培养板下放置0.2特斯拉的磁场，6 h更换培养基并去掉磁场，18 h后换液，48 h后加入浓度为5 mg·ml－1的MTT溶液20 μl，再培养4 h后吸干孔内液体，加入DMSO 150 μl，酶标仪检测540 nm处的吸光度。按细胞生存率(%)=(实验组OD值－空白组OD值)/(阴性对照组OD值－空白组OD值)×100%的公式计算细胞生存率，绘制细胞生长曲线。

1.2.4 不同载体对血管平滑肌细胞的体外转染 平滑肌细胞(第2代)培养到80%融合时，以2.0×106个的细胞密度接种 恒温混合气体(5%CO2和95%O2)环境中培养24 h后，分别以AdCMV-eNOS、磁聚糖-eNOS耦合物和磁聚糖空载体各50 μl加入3 ml无血清DMEM培养液中滤过后加入细胞，细胞培养板下放置0.1特斯拉的磁场，培养6 h后更换为10%FCS DMEM液继续培养。所有转染实验均重复3次。

1.2.5 免疫荧光染色检测转染后血管平滑肌细胞中eNOS蛋白的表达 上述转染的3组细胞传代时，将经高锰酸钾和浓硫酸预处理过的盖玻片放入培养皿底部，使细胞在其上生长，72 h后取出细胞爬片以兔多克隆抗人eNOS抗体(1∶100)和鼠抗兔免疫荧光抗体(1∶100)免疫荧光染色，荧光显微镜下观察3组eNOS的蛋白表达。

1.2.6 磁聚糖载体介导eNOS基因的转染效率及对eNOS mRNA表达的影响 同上方法转染48 h后收集3组细胞，通过流式细胞仪488 nm激发光激发，检测到绿色荧光阳性细胞占所有细胞的百分率，即为转染效率。

3组转染48 h后收集细胞，提取总RNA，逆转录成cDNA后进行RT-PCR扩增检测各组eNOS的mRNA表达。相应引物由上海申能博彩公司合成，eNOS为450 bp。PCR产物经1.2%琼脂糖凝胶进行电泳后，凝胶分析系统分析图像。

1.2.7 流式细胞仪检测转染后血管平滑肌细胞周期

血管平滑肌细胞生长至80%融合时转染重复感深度(MOI)为100的AdCMV-eNOS病毒、磁聚糖-eNOS耦合物和磁聚糖空载体，继续培养36 h，消化收集细胞于测定管中，快速注入75%乙醇固定沉淀细胞。PBS洗 2 次，离心，弃上清，加 0.1 mg·ml－1RNase 100 μl，37℃水浴30 min，PBS洗2次，加入碘化丙锭(PI)染液0.5 ml，4℃避光30 min，用流式细胞仪进行检测。

1.3 统计学处理

2 结 果

2.1 磁聚糖-eNOS基因耦合体的部分表征

2.1.1 包封率的测定 将 pH 值分别为 4、5、6、7、8、9的磁聚糖基因纳米混悬液于高速冷冻离心机上4℃、10 000×g离心1 h，吸取上清液10 μl，用去离子水稀释50倍，混匀后加入石英比色杯中，紫外分光光度计检测 处的吸光度 按公式包封率(W总－W游)/W总×100%(W总为壳聚糖纳米粒溶液中总的DNA含量，W游为壳聚糖纳米粒中游离的DNA量)计算得到包封率。当pH为5时，包封率最高可达82.4% ，DNA 最大结合量可以达到 9.5 μg·ml－1。

2.1.2 电泳分析 将pH=5的磁聚糖-eNOS纳米混合液经磁分离，分别收集上清液和磁粒子在0.8%琼脂糖凝胶上电泳30 min，凝胶成像系统观察拍摄，结果见图1。加上清液的第2、3泳道无条带，表明基因DNA几乎都与壳聚糖包裹磁性纳米粒子结合，上清液中几乎不存在基因DNA;加磁粒子的第4、5泳道及加eNOS质粒对照的第6、7泳道上均有条带显示，但位置不同，可见基因DNA已结合到壳聚糖包裹磁性粒子上。

图1 磁聚糖-eNOS纳米混合液的组分电泳图

2.2 血管损伤后平滑肌细胞培养鉴定

血管损伤后平滑肌细胞于3～5 d由组织块爬出，14～21 d爬满。用细胞爬片进行α-actin免疫化学鉴定，结果见图2。由图2可见，球囊损伤后血管平滑肌细胞与平滑肌细胞肌动蛋单克隆抗体α-actin结合的抗体少于正常血管平滑肌细胞。

2.3 磁聚糖纳米颗粒对平滑肌细胞的毒副作用

MTT法检测不同浓度的磁聚糖纳米颗粒对正常及受损后平滑肌细胞的毒副作用，结果(图3)显示在浓度为 0、5、10、20、40、80 mg·ml－1时磁聚糖纳米颗粒对正常及受损平滑肌细胞的生长均无明显影响，在160 mg·ml－1时对正常和受损后平滑肌细胞的抑制率分别为19.37%和16.24%。提示磁聚糖纳米颗粒浓度在低于20 mg·ml－1范围内时，对平滑肌细胞的生长无明显抑制作用。

图3 不同浓度磁性壳聚糖对平滑肌细胞生长的毒副作用

2.4 转染后血管平滑肌细胞中eNOS蛋白的表达

AdCMV-eNOS和磁聚糖-eNOS耦合物转染组受损平滑肌细胞免疫荧光染色呈阳性反应，后者平滑肌细胞荧光强度弱于前者，而磁聚糖空载体转染组呈阴性反应。见图4。

图4 转染后血管平滑肌细胞中eNOS蛋白免疫荧光检测

2.5 转染效率及对eNOSmRNA表达的影响

流式细胞仪检测发现磁聚糖-eNOS耦合物的转染效率为(58.7±3.6)%，较AdCMV-eNOS的转染效率［(78.1±2.5)%］低。

用RT-PCR方法检测发现，AdCMV-eNOS病毒和磁聚糖-eNOS耦合物转染组均检测出eNOSmRNA的表达条带，而磁聚糖空载体转染组为阴性，表明磁聚糖载体同样能成功将目的基因转染于平滑肌细胞中并有表达。见图5。

图5 RT-PCR检测不同载体介导eNOS基因转染的鉴定

2.6 转染后血管平滑肌细胞的细胞周期及凋亡检测

流式细胞仪检测结果(表1)显示，AdCMV-eNOS和磁聚糖-eNOS两组转染3 d后的血管平滑肌细胞G0/G1期细胞较磁聚糖空载体组明显增多，S/G2-M期细胞减少，3组的凋亡率差异不显著，提示磁聚糖-eNOS与AdCMV-eNOS转染都能使血管平滑肌细胞的细胞增殖周期延缓阻滞 但不影响细胞凋亡

表1 转染后血管平滑肌细胞的细胞周期检测±s)%

表1 转染后血管平滑肌细胞的细胞周期检测±s)%

与磁聚糖空载体转染组比较，a P＜0.01

组 别细胞周期G0/G1 S/G2-M 凋亡率AdCMV-eNOS转染组 75.3±1.4a 24.7±1.6a 4.72±1.8磁聚糖-eNOS转染组 68.9±2.3a 31.1±3.1a 4.96±2.5磁聚糖空载体转染组43.6±8.7 4.2±9.3 4.77±2.7

3 讨 论

随着PTCA的广泛开展，高达30%以上的冠状动脉术后再狭窄(restenosis，RS)的发生率也成为关注的焦点。目前普遍认为新生内膜形成和血管重塑是再狭窄的重要病理机制，而血管平滑肌细胞在此过程中发挥了重要作用［1］。因此，从基因治疗角度调控血管平滑肌细胞的增殖和凋亡，是防治再狭窄的一个重要方面。

近年的研究发现NO可以抑制血管平滑肌细胞的增殖、迁移，而NOS作为NO合成的关键酶，可以提高NO的活性，增加NO的合成，因而通过eNOS基因转染促进NOS表达［2-3］，对防治损伤后血管内膜新生和再狭窄发生具有重要作用。

基因载体选择是基因治疗中的一个关键。理想的基因载体［9］应具备以下特点:(1)靶向特异性，且被免疫系统识别;(2)高度稳定，易制备、浓缩和纯化;(3)无毒副作用;(4)基因能够高效转移和长期表达。病毒载体因其转移表达高效稳定被约80%的基因研究所选择［5］，但安全性一直是其临床应用的障碍。

壳聚糖非病毒载体是一种天然存在的甲壳素的脱乙酰产物，具有良好的生物相容性、降解性、低免疫原性、无毒等优点，但同时也存在转染效率相对较低、靶向性不好的缺点［10］。磁聚糖纳米材料［11-13］具有较高的正电性能吸附带有负电的质粒DNA，并通过Fe304磁核在外加磁场的作用下作定向移动，因而可以靶向性增强目的基因的摄取。

本研究将磁聚糖载体耦合eNOS基因质粒在体外对血管平滑肌细胞进行转染，发现正常浓度范围内该载体对细胞生长无明显毒副作用，虽然比重组腺病毒载体转染率较低，但同样可获基因成功转染和表达，并抑制血管平滑肌细胞增殖周期。实验发现，磁聚糖载体在耦合基因质粒时易发生团聚现象 调整合适的混悬液pH值及载体质粒质量比是获得稳定可靠纳米级基因耦合物的关键。此外，实验外加磁场强度和作用时间有利于提高转染效率，可以进行更深入的比较分析，并逐步开展支架磁化预处理及体内转染条件的摸索，为防治再狭窄的临床转化作进一步探索。

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