皮晋魁，张焕容

（西南民族大学生命科学与技术学院，四川 成都 610041）

本试验采用水稀释法初提IgY，然后分别用硫酸铵沉淀法和冰乙醇分级沉淀法进一步提取IgY，检测IgY提取量、纯度以及活性效价，为选择较好的鸡卵黄免疫球蛋白（IgY）提取方法提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 新鲜鸡蛋 购自成都农业科技职业学院实训中心。

1.1.2 主要设备和试剂 高速冷冻离心机centrifuge 5804、移液器（Eppendorf公司，德国）；电子天平（METTER TOLEDO公司，瑞士）；凝胶成像系统VerSa Doc2000、蛋白电泳仪、核酸蛋白检测仪（Bio-Rad公司，美国）。

0.1mol/L PBS（pH 7.4），0.028mol/L NaCl溶液，95%冰乙醇（-20℃预冷），考马斯亮蓝染液，SDSPAGE脱色液，30%丙烯酰胺，10%SDS，10%过硫酸铵，TEMED；0.1mol/L Tris-HCl（pH 8.8），0.1mol/L Tris-HCl（pH 6.8）；1000μg/mL结晶牛血清白蛋白，禽流感病毒H9亚型和新城疫病毒鸡胚尿囊液。

1.2 提取方法及步骤

1.2.1 卵黄液中水溶性成分（WSF）的分离 新鲜鸡蛋用卵黄分离器去除蛋白，之后将卵黄于滤纸上滚动，吸干，刺破卵黄膜，收集卵黄液。每枚鸡蛋抽取10mL卵黄液，分别置于离心管中，以8倍量去离子水稀释，搅拌10min，使水溶性IgY充分溶出。用0.1mol/L盐酸调节pH值为5.2，4℃静置过夜，然后10000 r/min，4℃离心25min，收集上清液，即得到澄清WSF。

1.2.2 冰乙醇分级沉淀法纯化IgY 取一半制备好的WSF，向其中加入95%冰乙醇，使冰乙醇终浓度达到60%（V/V），离心（10000 r/min，4℃，25min），沉淀用0.028mol/L NaCl溶解，过滤，去除脂蛋白沉淀，滤液再用终浓度为30%的95%冰乙醇沉淀后离心，离心后的沉淀即为IgY，于沉淀中加入10mL 0.1mol/L pH 7.4的 PBS。

1.2.3 硫酸铵沉淀法纯化IgY 取另一半WSF与等体积的0.lmol/L pH 7.4的 PBS混合,搅拌均匀，4℃下逐滴缓慢加入pH 7.0的饱和硫酸铵，至饱和度40%。4℃静置过夜，然后于4℃下11000 r/min离心25min，弃上清，沉淀用与WFS等体积的0.1mol/L pH 7.4的PBS溶解，混合均匀后再逐滴加入饱和硫酸铵至饱和度35%。……