谢秋群，唐雄志，罗兆芹，杨 炜，彭广涛

(桂林市人民医院，广西桂林541002)

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，近年来其具有年轻化趋势。2008年5月～2009年7月，我们观察了 pEFNB2-shRNA载体对人宫颈癌 Hela细胞EFNB2表达、增殖及凋亡的影响，初步研究其对宫颈癌侵袭转移生物学功能的影响，为其临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1．1 材料 人宫颈癌Hela细胞株，DMEM培养液、Lipo2000TM，线型载体 pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector、DH5α由本实验室保存;T4 DNA连接酶，限制性内切酶;DNA胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒，四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲亚砜(DMSO)、碘化丙啶(PI)，抗人ephrinB2抗体，小牛血清，其余试剂购自进口或国产。PCR引物合成和DNA测序由Invitrogen公司完成。

1．2 实验方法

1．2．1 pEFNB2-shRNA载体构建 根据 GenBank提供的EFNB2的mRNA全序列，采用Ambion公司的siRNA在线设计工具，选取2条21nt的序列:序列1(CCAGGAATAAAGATCCAACAA)、序列2(CTGGTACTATACCCACAGATA)，通过BLAST软件确定与其他非相关基因无同源性，合成相应的shRNA正义链及其互补链，两端包含BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位点及反向互补靶序列，被非同源序列(CTCGAG)隔开，3’末端加有TTTTTT终止序列。由Invitrogen公司合成，将得到的片段命名为EFNB2-shRNA1、EFNB2-shRNA2。与 pSIREN-DNR-DsRed-Express Vector连接后，以其为模板，采用PCR方法扩增出带有U6启动子的shRNA表达框，经测序正确，分别用EcoRⅠ和MluⅠ双酶切插入pEGFP-C1质粒，经电泳回收、纯化和转化后，挑取阳性菌落扩大培养后，抽提质粒DNA，经BamHⅠ和EcoRⅠ双酶切鉴定正确者送Invitrogen公司测序。

1．2．2 细胞培养及转染 取对数生长期的宫颈癌Hela细胞，以细胞数2×105/孔，接种于6孔板，待细胞生长至70%融合时，将两种构建的pEFNB2-shRNA载体和pEGFP-C1空质粒分别转染Hela细胞，并相应标记为实验组和对照组，未转染任何质粒的标记为空白组。按Invitrogen公司提供的 Lipo2000TM脂质体转染操作手册进行细胞转染。48 h后加入500 mg/L的G418进行筛选，并挑选稳定克隆进行鉴定，具明显沉默效应者转入培养瓶中扩大培养。

1．2．3 EFNB2 mRNA表达及EFNB2蛋白检测 收集转染48 h的各组细胞。采用RT-PCR检测各组EFNB2 mRNA表达:应用Trizol试剂抽提转染细胞总RNA，反转录为cDNA，PCR扩增，同时扩增β-actin作为内参照，PCR产物经1．5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察各组EFNB2 mRNA的表达情况并拍照。EFNB2反应条件:94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55．5 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30 个循环，72℃延伸10 min。β-actin反应条件:94℃变性4 min，94 ℃变性45 s，60 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s，30 个循环，72 ℃ 延伸 10 min。Western blot法检测各组EFNB2蛋白表达:蛋白经SDS-PAGE 60V电泳1．5 h后转移至硝酸纤维素膜，5%脱脂奶37℃封闭1 h，一抗(1∶500)4℃过夜，相应二抗(1∶1 000)37℃孵育1 h，显影定影液成像，同时检测β-actin(1∶500)的表达作为内参照。RT-PCR和Western blot检测结果用Uvp grabit Imagel软件采集，Gelworks 1D Advanced V4．01软件处理分析，计算各条带的积分吸光度(IA)，采用目的条带与βactin的IA比值表示EFNB2含量。

1．2．4 细胞生存率检测 采用MTT法。将Hela细胞按3×103个/孔接种于96孔板，按上述分组及转染方法，每组设6个复孔，于转染后12、24、48、72、96 h 分别加入10 mg/ml MTT 液10 μl，继续培养4 h后平板离心，弃上清，每孔加入DMSO 150 μl振荡溶解30 min，酶标仪测定各孔波长为570 nm的A值，计算各组A570平均值，按如下公式计算细胞生存率。细胞生存率=A实验孔/A对照孔×100%

1．2．5 细胞凋亡率检测 将Hela细胞接种无菌6孔板，按上述分组及转染方法，收取不同处理方式作用24、48 h后的各组细胞，PBS洗涤，调整细胞浓度为1×106个/ml，75%乙醇 －20℃过夜固定，检测前PBS洗涤1次，1 500 r/min离心5 min，加入含0．1%RNA 酶和 10 μg/ml PI的染色液 500 μl，室温避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞凋亡情况，并计算细胞凋亡率。

1．3 统计学方法 采用SPSS12．0统计软件，计量数据用±s表示，组间比较采用单因素方差分析。检验水准 α =0．05。

2 结果

2．1 EFNB2 mRNA及蛋白表达 见表1。

表1 各组EFNB2 mRNA及EFNB2蛋白表达(±s)

表1 各组EFNB2 mRNA及EFNB2蛋白表达(±s)

注:与对照组和空白组比较，*P＜0．05

组别 EFNB2 mRNA EFNB2蛋白实验组 0．16 ±0．04* 0．23 ±0．08*对照组 0．83 ±0．07 0．75 ±0．05空白组0．87 ±0．05 0．78 ±0．06

2．2 细胞增殖率 见表2。

表2 各组细胞生存率比较(%)

2．3 细胞凋亡率 见表3。

3 讨论

宫颈癌是女性常见恶性肿瘤之一，其治疗原则为早期以手术为主、辅以放化疗;晚期以放疗为主，辅以化疗。对于丧失手术机会的患者，基因治疗被认为是最有前途的方法之一［1］。RNAi是一种高效的特异性强的基因阻断技术，近年成为功能基因组研究的有力工具。同时，由于RNAi技术特异性高，作用迅速，不良反应小，在有效地沉默靶基因的同时，对细胞本身的调控系统无明显影响，是目前基因治疗研究的热点，其高效的序列特异性基因剔除技术在遗传性疾病和恶性肿瘤基因治疗领域发展极为迅速，为治疗遗传病、癌症等疾病开辟了新的途径。

表3 各组细胞凋亡率比较(%)

EFNB2基因定位于人类3号染色体q33，编码ephrinB2蛋白，是目前已知的酪氨酸蛋白激酶受体家族中最大的一个亚家族Eph/ephrin家族成员之一。研究发现，人类的许多生物学功能和病理过程都与Ephs/ephrins有关，包括血管形成、神经轴突导向、组织塑型、肿瘤生成等。其中EphB4/ephrinB2信号通路因其高度的血管生成特异性及与肿瘤侵袭、转移的相关性而成为医学专家关注的焦点［2，3］。大量研究显示，若抑制肿瘤细胞EphB4的表达，可明显减少肿瘤细胞的增殖、诱导细胞凋亡、抑制肿瘤侵袭和转移［4］。由于ephrinB2是EphB4的特异性配体，且都为跨膜蛋白，EphB4/ephrinB2信号通路的激活需依赖细胞间接触，而且信号传导是双向的，一般认为 ephrinB2激活 EphB4为正向信号，而EphB4激活ephrinB2为逆向信号，逆向信号经ephrinB2+细胞传导可促进肿瘤发展［5］。研究发现，EphB4/ephrinB2与妇科肿瘤的发生密切相关，EphB4和ephrinB2在宫颈癌细胞中表达明显增强，提示EphB4和ephrinB2在宫颈癌发生及血管生成中起重要作用［6］;干扰EphB4表达可明显减少肿瘤细胞增殖，诱导凋亡，抑制其侵袭和转移［7］。本研究pEFNB2-shRNA组EFNB2 mRNA、蛋白水平均明显低于对照组和空白组;细胞凋亡率明显高于对照组，生存率明显低于对照组。pEFNB2-shRNA载体能有效抑制细胞EFNB2基因表达，并可能通过干扰细胞ephrinB2表达而阻断逆向信号的传导，进而抑制细胞增殖，促进其凋亡。

总之，pEFNB2-shRNA载体能降低Hela细胞的增殖活性，促进其凋亡，其机制可能为抑制EFNB2基因表达。pEFNB2-shRNA载体的成功构建为进一步研究EFNB2基因的生物学功能提供了有力的工具。

［1］陈琰，向阳．宫颈癌的基因治疗［J］．癌症进展杂志，2008，6(5):463-467．

［2］Das A，Shergill U，Thakur L，et al．Ephrin B2/EphB4 pathway in hepatic stellate cells stimulates Erk-dependent VEGF production and sinusoidal endothelial cell recruitment［J］．Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2010，298(6):G908-915．

［3］Wu Q，Suo Z，Risberg B，et al．Expression of Ephb2 and Ephb4 in breast carcinoma［J］．Pathol Oncol Res，2004，10(1):26-33．

［4］Noren NK，Foos G，Hauser CA，et al．The EphB4 receptor suppresses breast cancer cell tumorigenicity through an Abl-Crk pathway［J］．Nat Cell Biol，2006，8(8):815-825．

［5］Foubert P，Silvestre JS，Souttou B，et al．PSGL-1-mediated activation of EphB4 increases the proangiogenic potential of endothelial progenitor cells［J］．J Clin Invest，2007，117(6):1527-1537．

［6］Zhang S，Jiang T，Liang M．Expression of EphB4 and Ephrin B2 in cervical cancer tissues and angiogenesis［J］．Int J Gynaecol Obstet，2007，96(1):46-47．

［7］Alam SM，Fujimoto J，Jahan I，et al．Coexpression of EphB4 and ephrin B2 in tumour advancement of ovarian cancers［J］．Br J Cancer，2008，98(4):845-851．