姚 萍，刘 廷，赵树鹏，高 源，齐凤杰*

(1辽宁医学院病理教研室，辽宁锦州121001;2辽宁医学院附属第一医院;3辽宁医学院人体解剖与组织胚胎教研室)

乳腺癌是妇女常见恶性肿瘤之一，其发生发展是多因素、多基因参与的复杂过程，包括多种癌基因的激活和抑癌基因的失活，这些基因之间的相互作用及异常改变与乳腺癌密切相关。近年来，我们观察了表皮细胞特异性标志物14-3-3σ、p73α蛋白在浸润性乳腺癌组织中的表达情况，旨在为乳腺癌的早发现、早诊断、早治疗提供可能的分子生物学指标。

1 材料与方法

1．1 材料 选择我院2006年5月～2011年2月手术切除的浸润性乳腺癌组织标本94份(浸润癌组)，患者年龄24～79岁，中位年龄52岁;均经病理证实且未进行放化疗及内分泌治疗。肿瘤直径≤2 cm 41例，＞2 cm 53例;腋窝淋巴结转移56例;ER受体阳性50例;PR受体阳性69例;HER-2受体阳性34例;按UICC 2003年TNM分期Ⅰ期29例，Ⅱ期40例，Ⅲ、Ⅳ期25例;根据2003年WHO乳腺癌分类非特殊型浸润性导管癌(组织学分级Ⅰ、Ⅱ级40例，Ⅲ级16例)56例，浸润性小叶癌18例，特殊型浸润性导管癌(黏液腺癌4例、髓样癌16例)20例。另选同期手术切除的导管原位癌标本15份(原位癌组)，上皮不典型增生标本15份(不典型增生组)，导管内乳头状瘤标本15份(乳头状瘤组)，乳腺增生症标本20份(增生症组)，乳腺癌旁5 cm标本10份(癌旁组)，各组一般资料无统计学差异。试剂:兔抗人p73α多克隆抗体(1∶100，武汉博士德生物公司)，鼠抗人14-3-3σ多克隆抗体(1∶100，北京中杉金桥生物公司)，PV-9000免疫组化试剂盒及DAB显色试剂盒均购自北京中杉金桥生物公司。

1．2 14-3-3σ、p73α 蛋白表达检测 采用免疫组织化学PV-9000两步法。4 μm切片脱蜡至水。置于3%H2O2内10 min灭活内源性过氧化物酶。抗原高压热修复后，自然冷却，滴加一抗，4℃冰箱过夜;PBS液冲洗2 min 3次，滴加试剂1(聚合物辅助剂)，37℃温箱内孵育20 min;PBS液冲洗2 min 3次，滴加试剂2(辣根酶标记羊抗鼠IgG多聚体)，37℃温箱内孵育30 min;PBS液冲洗2 min 3次，DAB显色，蒸馏水冲洗、苏木精复染、乙醇脱水、二甲苯透明、中性树脂封片。每批均设已知阳性切片作对照，用PBS缓冲液代替一抗作阴性对照。结果判定标准:14-3-3σ与p73α阳性表达均定位于导管和小叶上皮细胞胞质，出现清晰棕黄色颗粒为阳性。由2位以上病理医师采用双盲法观察。每切片随机选取5个高倍视野(×400)，共计数1 000个细胞。按阳性表达(A)及染色强度(B)评分，A评分:阴性为0分，阳性细胞率≤10%为1分，10% ～50%为2分，＞50%为3分;B评分:无色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。A×B记阳性标记指数(LI)，指数为0计为阴性(－)，1～3为弱阳性(+)，4～6为中等阳性(++)，7～9为强阳性(+++)。

1．3 统计学方法 采用SPSS17．0统计软件，各组间率比较采用χ2检验，14-3-3σ、p73α蛋白间关系采用Spearman相关分析法。检验水准α=0．05。

2 结果

2．1 14-3-3σ、p73α 蛋白表达 浸润癌组、原位癌组、不典型增生组、乳头状瘤组、增生症组、癌旁组的14-3-3σ 蛋白阳性率分别为 29．8%、66．7%、73．3%、86．7%、95．0%、80．0%，浸润癌组阳性率明显低于其余各组，P均＜0．05;p73α蛋白阳性率分别为 77．7%、53．3%、40．0%、26．7%、10%、0，浸润癌组阳性率明显高于其余各组，P均＜0．05。

2．2 14-3-3σ、p73α蛋白表达与乳腺癌临床病理特征的关系 见表1。

表1 14-3-3σ和p73α蛋白表达与浸润性乳腺癌临床病理特征的关系

2．3 相关性分析 浸润性乳腺癌中14-3-3σ和p73α 蛋白表达呈负相关(r= －0．823，P=0．000)。

3 讨论

14-3-3蛋白于1967年在动物大脑组织中发现，在哺乳动物中，14-3-3蛋白家族包括7种亚基(β、γ、ε、η、ζ、σ 和 τ/θ)，其中 14-3-3σ 与肿瘤的关系最密切［1］，是14-3-3家族中惟一一个能够被 DNA损伤所诱导的成员。14-3-3σ主要受抑癌基因p53调控［2］，作为一个细胞周期负调控因子，起活化可以引起细胞周期G2/M期阻滞，以发挥抑癌基因作用。14-3-3σ直接参与人类肿瘤的发生、发展，已有报道在多种人类恶性肿瘤中常有其蛋白或基因表达异常。14-3-3σ在乳腺癌中表达尚存争议，有研究认为其表达随乳腺癌的恶性进展呈下降趋势，而Moreira等报道14-3-3σ蛋白在乳腺癌中表达下调只是偶发事件。本研究显示，浸润癌组阳性率明显低于其余各组，提示14-3-3σ可能是一种保护性蛋白，在抑制乳腺细胞异常增生和恶性转化中起重要作用，其表达缺失可能与浸润性乳腺癌有关。Simooka等［3］发现，14-3-3σ蛋白表达随着肿瘤发展进行性下降，证实14-3-3σ作为肿瘤抑制因子存在于乳腺癌组织中。本研究还发现，14-3-3σ蛋白阳性表达与乳腺癌腋窝淋巴结转移、HER-2受体、组织学分级、TNM分期相关，而与年龄、肿瘤直径、组织学类型及PR、ER受体无关，提示14-3-3σ蛋白可能参与了乳腺癌的发生，且与其恶性程度、侵袭、转移相关。

p53基因具有野生型、突变型两种。野生型为抑癌基因，编码蛋白p53，具有“基因卫士”的作用，通过多种方式诱导DNA损伤细胞的凋亡;其在细胞中含量低，半衰期为20～30 min，很难检测，突变型p53蛋白含量高且半衰期长，可用免疫组化方法检测，因此细胞内p53阳性表达常被用于p53基因突变的检测。作为经典的抑癌基因，p53基因突变与近半数人类原发肿瘤的发生高度相关。

p73基因是Kaghad等在1997年发现的一个新基因，其编码序列与p53基因具有相当的同源性，据此将其命名为p73基因。其表达蛋白产物为TAp73和DNp73［4］，TAp73在结构上与 p53具有高度同源性，为p73蛋白羧基端选择性剪切形成，共有α、β、γ、δ、ε、ζ 等6种同源异构体，其中 p73α 以全长 mRNA形式表达。p73基因定位于人染色体1p36．33，是人1号染色体短臂(1p36)中一部分，研究提示该区可能隐藏多个抑癌基因。p73基因的特殊定位，支持其可能是一个新型的抑癌基因［5］。但在已检测的如乳腺癌、肺癌、神经母细胞瘤、肝癌及前列腺癌等人类肿瘤组织和细胞株中p73基因表达增高，且均未发现p73基因的突变［6］。其表达增高的机制还不明确，可能与 p53的突变和失活有关:Dominguez等［7］通过检测70例乳腺癌标本中 p73 mRNA的表达水平和1p36的杂合性缺失(LOH)，发现33%p53的组化染色阳性病例存在p73过表达，且两者差异有统计学意义。说明p73作为p53家族中的成员可代替突变型p53，调节其下游基因发挥诱导细胞凋亡的作用。耿翠芝等［8］和 Wakatsuki等［9］也分别证实，在p53缺失或者突变的乳腺癌细胞系中和放疗诱导细胞凋亡前后的68例宫颈鳞癌患者中，p73α表达上调，说明p73α能够补偿p53的缺失而发挥与其类似的抑癌功能，诱导14-3-3σ的表达，抑制肿瘤细胞生长。本研究显示，浸润癌组p73阳性率明显高于其余各组，提示确实存在p73α蛋白的高表达;并且在p53阳性的乳腺癌中，p73α显著高表达，14-3-3σ表达与p73α呈正相关，验证了上述p73α补偿上调14-3-3σ的观点。而浸润癌中14-3-3σ与p73α蛋白表达呈负相关，可能与本研究中p53阳性者比例有关。本研究还发现，p73α蛋白与乳腺癌腋窝淋巴结转移、ER及PR受体、TNM分期相关，提示p73α基因的高表达可能在乳腺癌的发生、发展及转移过程中起重要作用，并对乳腺癌的激素治疗有一定意义。

总之，14-3-3σ和p73α蛋白与浸润性乳腺癌的发生发展可能相关，两者联合检测可为乳腺癌早期诊断和治疗提供参考。

［1］Ferl RJ，Manak MS，Reyes MF．The 14-3-3σ［J］．Genome Biol，2002，3(7):3010．

［2］Hermeking H，Lengauer C，Polyak K，et al．14-3-3σ is a p53-regulated inhibitor of G2/M progression［J］．Mol Cell，1997，1(1):3．

［3］Simooka H，Oyama T，Sano T，et al．Immunohistochemical analysis of 14-3-3 sigma and related proteins in hyperplastic and neoplastic breast lesions，with particular reference to early carcinogenesis［J］．Pathol Int，2004，54(8):595-602．

［4］Ishimoto O，Kawahara C，Enjo K，et al．Possible oncogenic potential of Delta Np73:a newly identified isoform of human p73［J］．Cancer Res，2002，62(3):636-641．

［5］Kaghad M，Bonnet H，Yang A，et al．Monoallelically expressed gene related to p53 at 1p36，a region frequently deleted in neuroblastoma and other human cancers［J］ ．Cell，1997，90(4):809-819．

［6］Lchimiya S，Nimura Y，Kageyama H，et al．D73 at chromosome 1p36．3 is lost in advanced stage neuroblastoma but its mutation is infrequent［J］．Oncogene，1999，18(4):1061-1066．

［7］Dominguez G，Silva J，Silva JM，et al．Clinicopathological characteristics of breast carcinomas with allelic in the p73 region［J］．Breast Cancer Res Trear，2000，63(1):17-22．

［8］耿翠芝，桑梅香，王士杰，等．p53突变型乳腺癌细胞系中p73对细胞周期抑制因子14-3-3σ的调节作用［J］．中华实验外科杂志，2007，24(1):12-14．

［9］Wakatsuki M，Ohno T，Iwakawa M，et al．p73 protein expression correlates with radiation-induced apoptosis in the lack of p53 response to radiation therapy for cervical cancer［J］．Int J Radiat Oncol Biol Phys，2008，70(4):1189-1194．