黄芬香，杨春艳，庞春英，郑海英，尚江华，张秀芳，梁贤威

（中国农业科学院广西水牛研究所，广西水牛遗传繁育重点实验室，广西 南宁530001）

近年来，随着水牛产业的快速发展，商业性良种水牛胚胎的需求迅速加大。应用活体采卵技术生产良种水牛胚胎，可反复从优良性状母畜体内采集遗传背景清楚的卵母细胞生产胚胎，充分发挥优良母畜的繁殖潜力。但由于活体采卵技术回收到的良种水牛卵母细胞数量有限，且在活体采卵的过程中，通过真空泵的抽吸，不可避免地由于负压的的作用剥脱卵母细胞周围的卵丘细胞而产生较多的裸卵。在活体采卵回收到的卵母细胞中，卵母细胞可用率为70.92%，裸卵平均占回收总卵数的16.33%［1］。在这些裸卵中的一部分可能是AB级卵由于负压作用剥脱而形成的，具有成熟发育的潜力，受精后仍能有发育成胚胎的可能。因此，若能将这些裸卵在体外培养成熟进行受精，可增加活体采集可用卵母细胞的数量，使卵母细胞资源得以充分利用，以提高良种水牛活体采卵——体外生产胚胎的效率。众所周知，水牛体外受精是模拟体内受精卵、胚胎发育条件和环境来进行的，过程复杂，体外受精效果受诸多因素的影响。研究发现，卵丘细胞的存在与否严重影响卵母细胞的体外成熟质量［2，3］及随后的胚胎发育能力［4］。而在受精卵发育到胚胎的过程中，颗粒细胞具有重要的作用，与颗粒细胞制备的单层共培养可增强卵母细胞体外受精后发育到囊胚的能力［5］。本研究以屠宰本地水牛卵母细胞为研究对象，旨研究卵丘细胞对卵母细胞（包括裸卵）的体外成熟率、分裂率、囊胚发育率以及对比了不同牛品种颗粒细胞单层对水牛体外受精胚胎发育的影响，以探讨裸卵利用的可能性，为提高良种水牛体外胚胎生产效率提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料来源与保存

水牛卵巢来自广西南宁市屠宰场的成年母水牛卵巢，屠宰母水牛后取出卵巢，保存于35～37℃含有青、链霉素的生理盐水保温瓶中，在3h内运回实验室。水牛精液购自广西畜禽品种改良站，保存于－196℃的液氮中。

1.2 试验试剂

试剂均购自Sigma公司。洗卵液为含5%新生牛血清（NBS）和20mmol/L Hepes的 TCM199；体外成熟液为TCM199＋10%胎牛血清（FBS）＋50 μM 半胱胺＋10μg/mL FSH＋12U/mL LH＋1 μg/mL E2；洗 精 液 采 用 含 0.3% 牛 血 清 白 蛋 白（BSA）的改良 Tyrode＇S液；受精液为0.6%BSA＋60μg/mL肝素钠的改良Tyrode＇S液；胚胎培养液为10%NBS＋TCM199。

1.3 试验方法

以本实验室建立的水牛卵丘卵母细胞的IVM、IVF和IVC 为基础试验方法［6，7］。

1.3.1 卵母细胞的收集 采用卵泡穿刺法从直径2～8mm的明亮卵泡中吸取卵母细胞。在体视显微镜下挑选形态正常，周围有完整或部分卵丘细胞且细胞质均匀的卵母细胞以及形态正常的无卵丘卵母细胞进行成熟培养。

1.3.2 卵母细胞的体外成熟培养 将清洗好的卵母细胞移入成熟培养液中，放入二氧化碳培养箱中5%CO2、38℃条件下培养22～24h。取出部分COCs，用0.2%透明质酸酶去除卵丘细胞，观察生发泡破裂和第一极体排出的情况，计算卵母细胞的成熟率。

1.3.3 体外受精 用受精液在培养皿中做20μL的受精微滴，上覆石蜡油，放入CO2培养箱中预热平衡2h。精子上游法获取活精子，待用。去除包裹在成熟卵母细胞周围的部分卵丘细胞，只留1～2层。用受精液洗涤卵母细胞2～3次。将洗涤后的卵母细胞放入受精微滴中，每滴放入10个卵母细胞，再加入精子悬液，使得精子浓度为1.0～2.0×106个/mL。将含精卵的培养皿放回CO2培养箱中孵育20～24h。

1.3.4 胚胎的体外培养 精卵共育20～24h后，将受精卵周围残留的卵丘细胞吹打干净，用胚胎培养液洗涤2次，转入颗粒细胞单层微滴中置CO2培养箱，5%CO2、38.5℃和100%湿度条件下培养，20～24h后检查分裂情况，培养过程中每隔48h半量更换培养液，每隔24h观察胚胎发育情况。

1.3.5 试验设计

试验1：卵丘细胞对水牛卵母细胞体外受精及其胚胎发育的影响

将收集到的水牛卵母细胞分五组进行成熟培养。Ⅰ组为自然裸卵组：无卵丘细胞的AB级卵母细胞单独进行成熟培养；Ⅱ组为共成熟组：无卵丘的AB级卵母细胞与颜色透明的片状卵丘细胞块进行成熟共培养；Ⅲ组为人为裸卵组：包裹卵丘细胞的AB级卵母细胞人为去除卵丘细胞后与颜色透明的片状卵丘细胞块进行成熟共培养。Ⅳ组为非裸卵组：包裹卵丘细胞的AB级卵母细胞进行体外成熟后去除卵丘细胞再进行体外受精，Ⅴ组为对照组，即包裹卵丘细胞的AB组卵母细胞单独进行成熟培养。在各培养组的卵母细胞成熟培养22h后计算成熟率并进行体外受精及后续胚胎培养。

试验2：不同牛品种颗粒细胞单层对受精卵共培养效果的比较。

AB级卵母细胞经IVM、IVF后，在其受精20h后将假定受精的卵子分为两组，分别与水牛、黄牛的颗粒细胞单层进行共培养。

水牛颗粒细胞单层的制备：从水牛卵巢回收液中挑选光泽度好、细胞致密的大块颗粒细胞片，离心洗涤后将收集的颗粒细胞用胚胎培养液制成细胞密度为（1～2）×106个/mL的悬浮液，在60×15mm的塑料培养皿中做成30μL的微滴，并覆盖石蜡油。置于CO2培养箱中培养，待细胞长成单层后备用。

黄牛颗粒细胞单层：从屠宰场收集到的牛卵巢回收的卵泡液中挑选光泽度好、细胞致密的颗粒细胞碎片，培养液清洗2遍后，加入25%胰酶吹打1 min，离心（2500r/min，5min）洗涤2次，用胚胎培养液悬浮细胞，调整细胞密度为（1～2）×106个/mL，在60×15mm的塑料培养皿中做成30μL的微滴，并覆盖石蜡油。置于CO2培养箱中培养，待细胞长成单层后备用。

1.4 数据处理

试验数据采用SPSS 11.5软件进行统计分析。

2 结果

2.1 卵丘细胞对水牛卵母细胞体外受精及其胚胎发育的影响

从表1可以看出，各培养组卵母细胞在体外成熟培养22～24h后，在成熟率方面，自然裸卵组（Ⅰ组）与共成熟组（Ⅱ组）无显著差异（P＞0.05），但显著低于人为裸卵组（Ⅲ组）（P＜0.05），极显著低于非裸卵组（Ⅳ组）、对照组（Ⅴ组）（P ＜0.01）；共成熟组（Ⅱ组）较自然裸卵组（Ⅰ组）略有提高；人为裸卵组（Ⅲ组）与共成熟组（Ⅱ组）、非裸卵组（Ⅳ组）、对照组（Ⅴ组）均无明显差异（P＞0.05），但显著高于自然裸卵组（Ⅰ组）（P＜0.05）。在分裂率方面，自然裸卵组（Ⅰ组）、共成熟组（Ⅱ组）与人为裸卵组（Ⅲ组）无显著差异（P＞0.05），但自然裸卵组（Ⅰ组）与非裸卵组（Ⅳ组）、对照组（Ⅴ组）差异极显著（P＜0.01）。在囊胚率方面，自然裸卵组（Ⅰ组）极少出现胚胎，但与卵丘细胞共培养后囊胚率显著提高（P＜0.05）；人为裸卵由于系人为去除卵丘细胞致裸卵，因此发育潜能明显优于自然裸卵（P＜0.01），但与Ⅱ组无差异；非裸卵组（Ⅳ组）因是由AB级卵经成熟后去除卵丘细胞授精，效果优于Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ组，但这四组的囊胚率均极显著差于对照组（Ⅴ组）（P＜0.01）。这表明，卵丘细胞无论是在体外成熟或是体外受精的过程中都起着举足轻重的作用，但相对自然裸卵而言，虽然在与卵丘细胞共培养后成熟率、分裂率、囊胚率略有提高却未能够取得较理想的培养效果。

表1 卵丘细胞对水牛卵母细胞体外受精及其胚胎发育的影响

2.2 不同牛品种共培养细胞对水牛受精卵发育的影响

从表2可以看出，正常AB级卵母细胞细胞经体外成熟和体外受精后，受精卵分别与黄牛颗粒细胞单层和水牛颗粒细胞单层进行共培养，结果发现，不同品种颗粒细胞单层的分裂率和囊胚率差异显著，水牛颗粒细胞单层的分裂率和囊胚率均明显高于黄牛的（P＜0.05）。结果表明，应用本培养系统，采用水牛颗粒细胞单层共培养组的效果较优于黄牛颗粒细胞单层共培养组。

表2 不同牛品种共培养细胞对水牛受精卵发育的影响

3 讨论

在水牛胚胎的体外生产中，卵丘细胞对于卵母细胞成熟有极其重要的作用［8］，主要表现在卵丘细胞参与维持卵母细胞减数分裂阻滞，诱导卵母细胞减数分裂恢复、支持卵母细胞细胞质的成熟［9］，并进而提高其受精后的卵裂率和发育率。已有实验表明，在体外成熟的过程中，一些生长因子能不同程度地促进卵母细胞的体外成熟，提高成熟卵继续发育的能力，但生长因子的作用，必须由卵丘细胞缝隙连接介导，对裸卵无作用［10］。本实验研究也发现，自然裸卵在正常情况下培养，极少出现囊胚，但其与卵丘细胞共培养后，在成熟率、分裂率、囊胚率方面有所提高；机械裸卵，即假定的回收裸卵中的一部分，其有可能是卵母细胞回收过程中由于外部原因人为地打光卵丘细胞所致，这一部份机械致光的卵比自然裸卵更有发育潜力，因此，其发育效果较优于自然裸卵。研究也证实了卵丘细胞不仅只是在体外成熟的过程中起着决定性的作用，在体外受精的过程中也发挥着重大作用，这也与 Fatechi［4］和 Li［11］等试验证明卵丘细胞的存在有利于卵母细胞体外成熟及受精后发育的结论一致。非裸卵组，在AB级卵母细胞常规体外成熟后，机械打光后受精，虽然其发育结果比自然裸卵、自然裸卵共培养和机械裸卵要好，但仍然比对照组有较显著的差异，这与在牛上的试验结果基本一致［12］。其次，卵母细胞周围的卵丘颗粒细胞能帮助精子获能和穿入卵母细胞［13］，能够明显提高受精胚胎的发育［14，15］。因此本试验的卵母细胞在受精时包裹卵丘细胞与成熟后打光卵丘细胞受精相比，明显提高了水牛体外受精的卵裂率和囊胚率。

利用颗粒细胞单层共培养，有利于水牛体外受精卵的发育，但不同牛品种的颗粒细胞单层培养效果有所差异，这在本试验中也得到了证实，应用水牛颗粒细胞单层的共培养效果明显优于黄牛颗粒细胞单层的培养效果。究其原因可能为，同科不同属的颗粒细胞所产生的肝素结合细胞因子（midkine）和其它一些细胞因子对水牛胚胎体外发育能力虽然都有促进作用，都能除去培养液中某些对水牛胚胎发育不利的毒性代谢产物，调节培养液中的氧张力而阻止氧化应激，稳定培养液的各种生化参数，使水牛胚胎在一个相对稳定的内环境中生长发育［16］，但作用与其在同属的颗粒细胞各不相同，卵母细胞或者在与其相对应的科属的颗粒细胞单层中共培养效果更好。

4 结论

综合结果看出，卵丘细胞虽对裸卵的体外成熟培养及其受精分裂效果没有明显的改进作用，但能显著提高其囊胚率；卵丘细胞在AB级卵母细胞受精过程中的促进作用能显著提高囊胚率。说明卵丘细胞有助于水牛卵母细胞的体外成熟、体外受精及其胚胎发育；在受精卵培养过程中，应用同科属的水牛颗粒细胞单层共培养效果明显优于黄牛颗粒细胞单层的效果。

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