黎满香,林荣高,颜运秋,卿泰安,卢 帅,蒋 伟,陈 滔

(湖南农业大学动物医学院,湖南长沙410128)

猪链球菌是引起猪链球菌病的主要病原,临床上主要表现为败血症、脑膜炎以及关节炎,并还常与其他疾病混合感染,使病情更加复杂。猪链球菌是世界范围内引发猪链球菌病最主要的病原,目前已有35个血清型(1～34及1/2)被确定,其中猪链球菌2型流行最广、致病性最强[1]。该菌的致病因子较为复杂,不同菌株的致病性不同,致病性的强弱取决于它的毒力因子,主要有荚膜多糖(capsular polysaccharide,cps),溶菌酶释放蛋白(muramidase-released protein,mrp),胞外因子(extracellular factor,epf),溶血素(suilysin,sly)等[2-5]。目前我省猪链球菌分离株的毒力因子基因分布情况还不清楚。因此本试验对我省分离的猪链球菌2型进行毒力因子的检测和基因序列分析,初步了解我省主要的毒力因子和分子生物学特性。

1 材料与方法

1.1 菌株 猪链球菌2型分离株Hunan-An1、Hunan-An2、Hunan-CS、Hunan-Ping 共四株,分离于湖南省临床送检的猪病料,并按参考文献方法进行生化及PCR鉴定,确定为猪链球菌2型[6],由湖南农业大学动物传染病实验室保存。

1.2 主要试剂及培养基 Taq DNA Polymerasea购自天根生物工程公司;dNTP(2.5 mmol/L)、DL-2 000 DNA Marker均购自宝生物工程(大连)有限责任公司;凝胶回收试剂盒购自新长江生物技术有限公司;选择性Todd-Hewitt肉汤(T HB)与血清琼脂培养基均用分析纯试剂配制。

1.3 引物设计 参照GenBank报道的相关基因序列分别设计引物,并由北京奥科生物技术有限责任公司合成。cps2j:上游 5′-ATGT TTGGAATACGCAGAGCAAG-3′,下游 5′-AGAGGACGTTC

GTT TAATACT TAG-3′;mrp:5′-CCAAGTATGGTGATGTCATTGT TG-3′,下游 5′-GGTACAT T TGGAATCTCTGGAATC-3′;epf:上游 5′-ACTCT TCTGAGCTGACGGAACAG-3′, 下 游 5′-TAGGTGTCATGACTGGTGCT TTAG-3′;sly:上游 5′-GTGACTTACGAGCCACAAGAGAT TC-3′,下游5′-ACTCCTACTGCTAGT TTCTAAC-3′;扩增 片段大小分别为:717 bp 、773 bp、683 bp 、689 bp。

1.4 PCR扩增及回收 10×PCR Buffer 2 μ L,dNTP(2.5 mmol/L)1 μ L,上 、下游引物各 1 μ L,Taq 酶(2.5 U/μ L)0.5 μ L,加水至 20 μ L 总体系。……