林居纯,曹三杰,蒋红霞,曾振灵

(1.华南农业大学兽医学院广东省兽药研制与安全评价重点实验室,广东广州510642;2.四川农业大学动物医学院,四川 雅安 625014)

细菌性感染一直危害着畜禽健康,对病原菌做出快速准确诊断是控制疾病发展前提。细菌常规鉴定所需时间长,尤其对生长缓慢或难以培养病原菌要做出及时正确诊断显得更加困难。随着分子生物学发展,PCR技术已被用于临床检测病原菌,但常规PCR需设计针对病原菌的特异引物,对分离未知细菌或混合感染,则难以实现快速诊断目的[1-2]。

本试验利用细菌种系发育过程中具有重要意义的16S rDNA基因为检测靶点,构建了细菌16S rDNA基因芯片,并对兽医临床重要病原菌进行了检测,为实现基因芯片技术应用于兽医临床提供初步研究。

1 材料与方法

1.1 标准菌株 大肠杆菌ATCC25922(Escheria coli)、沙门菌 C79-13(Salmonella pullorum)、金黄色葡萄球菌ATCC25923(Staphylococcus aureus)、无乳链球菌CVCC1887(Streptococcus agalactiae)、鸡毒支原体 PG31(Mycoplasma gallisepticum)由本实验室保存提供。

1.2 主要试剂及仪器 质粒DNA提取试剂盒购自Omega Bio-tek公司;PCR相关试剂及pMD18-T载体购自TaKaRa公司;氨基基片、杂交缓冲液等购自上海百傲科技有限公司;Cy3-dCTP购自Amersham Biosciences;Lambda定位基因由四川农业大学基因芯片实验室提供;SpotArrayTM24芯片点样仪、ScanArray·4000扫描仪购自Packard Bioscience公司;PX2梯度PCR仪购自Thermohybaid公司;2000型凝胶电泳图像分析系统、Smart SpaceTM3010核酸蛋白检测仪购自Bio-RAD公司。

1.3 引物设计 参考E.coli等5种微生物16S rDNA序列,设计扩增16S rDNA V1-V3区490 bp片段的通用引物。引物序列16S1:5′-AGGCCTAACACATGCAAGT-3′,16S2:5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′。

1.4 靶基因克隆、鉴定及制备 将 E.coli ATCC25922等5种标准菌株,采用水煮沸法提取DNA用作PCR模板。PCR体系:dNTP(各 2.5 mmol/L)5.0 μ L,Ex Taq(5 U/μ L)0.25 μ L,10 ×ExTaq Buffer 5.0 μ L,引物 16S1 和 16S2(10 μ mol/L)各 1.0 μ L,模板 2.0 μ L,加 ddH2O 至 50 μ L 。 反应参数:94℃预变性5 min,94℃变性30 s,52℃退火30 s,72℃延伸25 s,共30个循环,72℃延伸5 min。……