谢莉 何振华 谭小武

肺纤维化(pulmonary fibrosis，PF)是一种以肺间质损害和纤维化为病理学特征的弥漫性肺间质性疾病[1]。其病因不明，但危害严重，一般而言，本病确诊后平均生存期约3～5年，5年生存率仅30%～50%[2-3]。近年研究表明，基质金属蛋白酶(MMPs)及其抑制剂(TIMPs)在细胞外基质的降解与重塑过程中发挥重要作用[4-5]。在本研究当中，我们拟建立大鼠肺纤维化模型，探索匹伐他汀对博来霉素致大鼠肺纤维化中干MMP-9和TIMP-1表达的影响，以进一步明确其抗纤维化作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

博来霉素为日本化药株式会社产品（批号740104），匹伐他汀为广东东阳光药业有限公司产品(纯度：95.6%，批号：0703001）。SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、ECL发光试剂盒购自江苏碧云天生物技术有限公司。MMP-9单克隆抗体购自Santa Cruz。TIMP-1多克隆抗体为武汉博士德生物工程有限公司产品。HRP标记羊抗鼠多克隆抗体购自北京博奥森生物技术有限公司。碱性磷酸酶显色剂购自普洛麦格。

1.2 实验分组与动物模型的建立

54只健康大鼠雄性SD大鼠随机分为模型组、阴性对照组以及匹伐他汀组，各18只。将大鼠仰卧固定于操作台上，经10%水合氯醛腹腔注射麻醉(2.5mL/kg)后，颈部消毒，分离暴露气管，注射器经气管软骨环间隙朝向心端刺入气管并缓慢注入0.3mL博莱霉素生理盐水溶液(5mg/kg)或生理盐水溶液，注后立即将动物直立并左右旋转，使药液在肺内均匀分布。对照组注入等体积的生理盐水。

1.3 标本的采集与处理

在造模2、4、6周进行取材（腹腔动脉放血法处死实验大鼠），每次各组随机处死6只。取右肺组织切成小块存于无菌EP管中，同时获取肺泡灌洗液（BALF）置于-80℃冻存以用于下一步研究。

1.4 Western blot检测MMP-9和TIMP-1的表达

按试剂盒说明提取上述肺组织蛋白并进行SDS-PAGE电泳。结束后按照半干转印法将蛋白转印到硝酸纤维素膜上，用含5%脱脂牛奶的TBS溶液室温封闭2h，PBST洗涤后与抗HO-1抗体于4℃孵育过夜。最后与HRP标记的羊抗鼠IgG二抗室温孵育2h。暗室发光显影，灰度扫描。

1.5 ELISA检测肺泡灌洗液中MMP-9以及TIMP-1的产生

获取肺泡灌洗液，并按照试剂盒说明书提前15min配制好工作液。操作步骤按照试剂盒提供的方法进行。包括绘制标准曲线，加入样品，洗涤，显色等步骤。最后于波长450nm下用酶标仪测定其OD值。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 肺泡灌洗液中MMP-9，TIMP-1浓度

肺泡灌洗液中MMP-9，TIMP-1浓度见表1所示。在模型组中，MMP-9浓度在第2周水平最高，随后开始下降，但第6周水平依然高于阴性对照组。匹伐他汀处理后，MMP-9浓度均低于同期模型组，但同样也高于对照组。TIMP-1的产生情况与MMP-9类似。见表2。

表1 各研究组大鼠BALF中MMP-9浓度（ng/ml）

表2 各研究组大鼠BALF中TIMP-1浓度（ng/ml）

2.2 MMP-9和TIMP-1蛋白表达情况

与对照组相比，博莱霉素模型组在第2周时MMP-9和TIMP-1蛋白表达明显增高。4周后，MMP-9表达水平有所减少，但TIMP-1依然呈高水平表达，直到第6周才略有降低。匹伐他汀处理组MMP-9和TIMP-1均低于模型组水平。见图1，图2。

图1 各组MMP-9表达情况 图2 各组TIMP-1表达情况

3 讨论

肺纤维化的发生是一个非常复杂的病理生理过程，尽管病因各异，但肺组织中的基质代谢异常是本病中的共同特征，在此过程中，MMPs及其抑制剂TIMPs在细胞外基质的讲解与重塑过程中发挥至关重要作用[5]。任何能引起其合成和降解异常的因素都可以引起细胞外基质聚集，最终导致肺纤维化的形成。博莱霉素是用于建立纤维化模型的理想药物。在早期诱导的纤维化过程中，由于博莱霉素所诱发的炎症反应促进免疫细胞合成和释放一系列炎症细胞因子，从而引起MMPs的合成与活化。因此这时期尚未出现细胞外基质堆积。在继发性修复阶段，MMPs的活性有所降低，而TIMP-1表达仍维持在较高水平，引发了MMP-9/TIMP-1的比例失衡，从而引起纤维化的发生[6-7]。我们的研究结果也显示，模型组在2～6周内，随着时间延长，MMP-9含量逐渐降低，而6w时TIMP-1依然表达持续升高，与上述理论相符。

匹伐他汀是第一个全合成的HMG-CoA还原酶抑制剂，是一类降脂药物[8]。近年的研究显示，他汀类药物能可通过抑制MMPs活性、抑制成纤维细胞增殖以及胶原合成、调节细胞外基质的降解，因此可能具有抗纤维化的作用[9]。但直接进行动物实验并观察其抗肺纤维化方面的研究并不多。在本研究当中，我们通过动态观察结果显示，匹伐他汀处理后，博莱霉素所致的肺纤维化在2周、4周和6周时，匹伐他汀均表现出明显的降低MMP-9及TIMP-1的作用，尤其以第4周（肺纤维化形成期）MMP-9的降低作用尤为明显。这可能是匹伐他汀减轻基底膜损伤、减轻肺泡炎性渗出的重要机制。6周后，肺内主要病理生理改变为肺纤维化，而匹伐他汀在此时期依然能降低MMP-9的水平，同时也能降低TIMP-1的表达水平，使MMPs/TIMPs趋于平衡，最终延缓/抑制纤维化的发生发展。综上所述，匹伐他汀能降低肺纤维化大鼠模型中MMP-9和TIMP-1水平，因此有望成为治疗本病的辅助用药。

[1]Lee JS, McLaughlin S, Collard HR. Comprehensive care of the patient with idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Curr Opin Pulm Med, 2011.

[2]Todd NW, Atamas SP. Survival in pulmonary fibrosis combined with emphysema: likely defined by characteristics of specific patient subpopulations[J]. Fibrogenesis Tissue Repair, 2011,4(1):17.

[3]陈佰义.特发性肺纤维化诊断和治疗的若干问题[J].当代医学,2001(07):42-45.

[4]Manni ML, Czajka CA, Oury TD, et al. Extracellular Matrix Powder Protects Against Bleomycin-Induced Pulmonary Fibrosis[J]. Tissue Eng Part A, 2011.

[5]Dancer RC, Wood AM, Thickett DR. Metalloproteinases in idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Eur Respir J, 2011.

[6]Patel RB, Kotha SR, Sherwani SI, et al. Pulmonary fibrosis inducer, bleomycin, causes redox-sensitive activation of phospholipase D and cytotoxicity through formation of bioactive lipid signal mediator,phosphatidic acid, in lung microvascular endothelial cells[J]. Int J Toxicol,2011,30(1):69-90.

[7]Degryse AL, Lawson WE. Progress toward improving animal models for idiopathic pulmonary fibrosis[J]. Am J Med Sci, 2011,341(6):444-449.

[8]Ahmad H, Cheng-Lai A. Pitavastatin: a new HMG-CoA reductase inhibitor for the treatment of hypercholesterolemia[J]. Cardiol Rev,2010,18(5):264-267.

[9]Kim JW, Rhee CK, Kim TJ, et al. Effect of pravastatin on bleomycin-induced acute lung injury and pulmonary fibrosis[J]. Clin Exp Pharmacol Physiol, 2010,37(11):1055-1063.