赵 琼，孙黔云，杨庆雄

(1.贵州大学生命科学学院，贵州贵阳 550025;2，贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室，贵州贵阳 550002;3，贵州师范大学化学与材料科学学院，贵州贵阳 550001)

脑缺血具有高致死率和高致残率的特点，其损伤机制复杂，参与因素众多，其中之一就是补体的过度激活［1］。在正常生理状态下，补体参与脑内特异性及非特异性免疫，介导凋亡细胞的清除等。在缺血缺氧等病理状态下，脑内补体蛋白表达上调［2］，大量补体活性片段沉积在凋亡的神经细胞表面［3］。控制补体过度激活对脑缺血动物模型表现出良好的保护作用［4－5］。随着对补体及其在病理过程中所发挥作用的深入研究和认识，补体抑制剂已成为当今药物研究的热点之一，并已有数个补体抑制剂进入临床试验［6］。在前期工作中，我们对部分贵州民族药资源进行了较为系统的活性筛选，从香椿果中筛选出一个高活性抗补体多酚类化合物。为进一步认识其抗补体性质及评价其潜在应用前景，本工作构建了补体损伤神经细胞模型，评价了该化合物对补体损伤神经细胞的保护作用。

1 材料与方法

1.1材料MEM、F12细胞培养基和胎牛血清均购自美国Hyclone公司;MTT购自美国Sigma公司;乳酸脱氢酶活性检测试剂盒购自南京建成生物工程研究所;Caspase-3/7活性检测试剂盒购自美国Promega公司;眼镜蛇毒因子(cobra venom factor，CVF)为本课题组制备，其分离纯化［7］和激活补体活力的测定［8］参照文献方法;正常人血清(normal human serum，NHS)为5名健康志愿者献血制备而得，混匀，分装，冻存于－80℃，经补体活性检测后使用;灭活人血清(inactivated normal human serum，INHS)为正常人血清于56℃孵育30 min所得。

1.2仪器Forma 3111型CO2培养箱(美国Thermo公司);Spectra MAX 190连续波长酶标仪(美国Molecular Devices公司);GloMax发光检测仪(美国Promega公司);5810R型低温离心机(德国Eppendorf公司);Nikon TS100倒置相差显微镜(日本Nikon公司);Revco超低温冰箱(美国Thermo公司);Milli Q超纯水系统和Elix纯水系统(美国Millipore公司)。

1.3方法

1.3.1香椿果抗补体活性成分的制备香椿果干品经甲醇提取，氯仿、乙酸乙酯、石油醚萃取，取乙酸乙酯萃取部分，经硅胶柱色谱以氯仿:甲醇(15∶1～1∶1)洗脱，得3部分，其中第3部分(1∶1洗脱部分)再通过葡聚糖凝胶Sephadex LH-20色谱柱，以甲醇水溶液为洗脱剂(10% ～100%)进行梯度洗脱，其中80%洗脱部分再经ODS柱层析后得到的化合物经1H-NMR，13C-NMR和MS数据与文献对比，结构为 1-O-甲基-2，3，4，6-四-O-没食子酰基-吡喃葡萄糖，命名为XCG-7，其结构如Fig 1所示。

1.3.2细胞培养人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y购于中国科学院上海细胞库，用含10%胎牛血清的等体积混合MEM/F12培养基于37℃、5%CO2饱和湿度的条件下培养。

Fig 1 Structure of XCG-7:1-O-methyl-2，3，4，6-tetra-O-galloyl-β-D-glucopyanose

1.3.3补体激活损伤SH-SY5Y细胞的条件选择研究

1.3.3.1血清浓度的确定 取对数生长期细胞以2.5 ×108个·L－1，90 μl/孔，接种于 96 孔板，培养24 h进行实验。将细胞分为以下组别:模型组，加入不同体积 NHS(体积百分数分别为5%、10%、15%、20%)及 10 μl 2 000 U·L－1CVF;正常生长对照组，只含正常培养基。各孔用培养基补足200 μl。各组继续培养24 h后，更换为100 μl正常培养基，再加入 5 g·L－1的 MTT 20 μl/孔，4 h 后加入溶解液50 μl/孔，过夜，次日于酶标仪570 nm波长处测定光吸收值。

1.3.3.2激活血清对不同密度细胞的作用 将SH-SY5Y 细胞以5.0 ×108、2.5 ×108、1.25×108个·L－1，90 μl/孔，接种于 96 孔板，培养 24 h 进行实验。将各个密度细胞分别设置以下组别:模型组，即含有15%NHS 及 10 μl 2 000 U·L－1CVF;正常生长对照组。各孔用培养基补足200 μl。各组继续培养24 h和48 h后，吸取细胞上清，按试剂盒说明书测定细胞上清液中乳酸脱氢酶;按“1.3.3.1”所述的MTT法测定细胞活力。

1.3.4XCG-7的配制取适量 XCG-7样品溶于DMSO溶液中，配成浓度为100 g·L－1的储备液。使用时，根据需要，用正常培养基稀释成不同浓度。DMSO在实验体系中终浓度低于1%。

1.3.5XCG-7对SH-SY5Y细胞生长的影响测定将SH-SY5Y细胞按“1.3.3.2”中所述的3个密度接种于96孔板，培养24 h后，加入不同浓度XCG-7溶液，继续培养24 h后，去掉含有XCG-7的培养基，并按“1.3.3.1”所述的MTT法测定细胞活力。

1.3.6XCG-7对补体损伤SH-SY5Y细胞的保护作用测定将“1.3.3.2”中所述的3个密度细胞均设置以下组别:模型组、样品组(高、低剂量)、灭活血清组及正常生长对照组。模型组和正常生长对照组组成与“1.3.3.2”所述相同;高、低剂量样品组分别在模型组的基础上加入终浓度为200和100 mg·L－1的 XCG-7;灭活血清组用等体积的 INHS取代NHS。各组继续培养24 h后按试剂盒说明书测定Caspase-3/7活性;于24 h和48 h后，测定乳酸脱氢酶和细胞活力。

1.3.7统计学分析实验数据以±s表示。各组间用单因素方差分析进行比较。

2 结果

2.1补体激活对SH-SY5Y细胞的影响不同浓度的激活血清作用于SH-SY5Y细胞显示，较高浓度的激活血清能明显降低SH-SY5Y细胞活力(Fig 2A)。15%激活血清作用于3个接种密度的细胞，各密度模型组较对照组LDH释放明显增加(Fig 2B)，细胞活力明显下降(Fig 2C)。

2.2 XCG-7对SH-SY5Y细胞生长的影响XCG-7对SH-SY5Y细胞表现出生长促进作用(Fig 3)。

2.3XCG-7对补体损伤SH-SY5Y细胞活力的影响XCG-7组细胞活力明显提升，明显减轻补体对SH-SY5Y的损伤(Fig 4)。

2.4XCG-7对补体损伤SH-SY5Y释放乳酸脱氢酶的影响XCG-7在一定程度上能降低补体损伤导致LDH的释放(Fig 5)。

2.5XCG-7对补体损伤SH-SY5Y活化Caspase-3/7的影响激活补体损伤的SH-SY5Y细胞Caspase-3/7活性明显低于正常组，而各样品组Caspase-3/7活性与模型组相比未表现出差异(Fig 6)。

3 讨论

本工作通过构建补体损伤神经细胞的模型，评价香椿果抗补体活性多酚XCG-7对补体损伤神经细胞的保护作用，结果显示该化合物能促进SHSY5Y细胞生长，在一定程度上能减轻补体对神经细胞的损伤。

补体在脑缺血/再灌注损伤中具有重要作用［1，4－5］，因此，在细胞水平上建立特定条件的补体损伤模型，不仅有利于补体抑制剂的初筛，而且相对动物模型因素单纯，简便易行，也更适合补体抑制剂相关作用机制的研究。目前在细胞水平上补体损伤神经细胞的模型尚未见报道。我们采用能特异激活补体替代途径的CVF作为工具，激活NHS作用于SH-SY5Y细胞。CVF能与B因子形成替代途径的C3/C5转化酶，该转化酶不受内源性补体调节蛋白的抑制，持续激活补体［8］。在本工作的实验体系中，我们选择能最大限度激活血清补体的CVF合适剂量，使补体活化超过细胞表面补体调节蛋白的调控能力而损伤神经细胞。这种补体激活方式与体内病理生理状态下补体过度激活最为接近。

Fig 2 Influence of activated complement on SH-SY5Y cells

Fig 3 Effect of XCG-7 on SH-SY5Y viability

Fig 4 Effect of XCG-7 on cell viability of SH-SY5Y injured by activated complement

Fig 5 Effect of XCG-7 on LDH release of SH-SY5Y injured by activated complement

Fig 6 Effect of XCG-7 on Caspase-3/7 activity of SH-SY5Y injured by activated complement

在本工作中，XCG-7单独作用于SH-SY5Y细胞，在一定的浓度范围内表现出与剂量相关的生长促进效应。XCG-7能明显抑制补体诱导的细胞活力降低。然而，XCG-7不能降低早期补体损伤导致的LDH释放;随着作用时间的延长，模型组LDH释放继续增加，但XCG-7组LDH释放量较模型组已明显下降，在一定程度上降低了LDH的释放。

Caspase-3/7为细胞凋亡晚期的关键酶，其一旦活化，细胞凋亡就不可逆转。Caspase-3/7活性在各密度正常生长细胞中比例恒定，其反映了正常细胞凋亡的发生率。通过对不同时间点模型组Caspase-3/7活性进行测定，确定其凋亡信号高峰在24 h(数据未列出)。然而，在24 h模型组Caspase-3/7活性却较正常组低。有文献报道，不同的损伤刺激可通过坏死［9］或非 Caspase-3 介导的凋亡［10－12］导致神经细胞死亡，这种死亡过程不产生Caspase-3/7凋亡信号。模型组细胞活力的降低与凋亡信号的降低几乎一致，提示细胞数量减少是模型组Caspase-3/7活性下降的主要原因。但其确切机制还有待进一步研究。在本实验中XCG-7组Caspase-3/7活性明显低于正常组。多酚类物质普遍能通过上调Bcl-2/Bax比例、激活 PKC等途径抑制神经细胞凋亡［13］，且XCG-7组细胞活力与正常对照组相当，提示XCG-7可能抑制细胞凋亡。

多酚类物质广泛分布于植物中。多酚类化合物如茶多酚、白藜芦醇等明确具有改善认知功能、抗氧化、抗癌、抗炎等活性［14－15］，但具有抗补体活性的多酚类化合物还尚未见报道。本工作以SH-SY5Y为靶细胞，进行了XCG-7对补体损伤的保护作用研究，结果显示该化合物对补体损伤神经细胞具有一定的保护作用。这种抗补体活性和相应的保护作用在多酚类物质中是否普遍存在，值得进一步探讨和研究。

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