张 芳，董 海，岳 旺

(青岛大学医学院1.药学系、2.附属医院(东区)重症医学科，山东青岛 266021)

MES 23.5细胞是由大鼠中脑细胞与小鼠神经母细胞瘤－胶质瘤细胞株18TG2经细胞融合技术形成的一种DA能细胞株，具有中脑黑质DA能神经元的许多特性，它含有酪氨酸羟化酶，能够合成DA(多巴胺)，但不合成其他儿茶酚胺［1］。氧是需氧生物生存的基本要素，但同时也是生成有害的活性氧(reactive oxygen species，ROS)的前体。当细胞内氧化与抗氧化系统之间的平衡被打破，ROS生成能力超过清除能力或外源ROS大量涌入体内时，氧化应激便产生了。这是包括神经退行性疾病在内的50多种疾病的一个重要的发病机制［2］。H2O2是众多种类ROS中最重要的一种，H2O2凭借其良好的细胞膜渗透性可以轻易的进入细胞内部，并产生细胞毒性［3］。故本实验我们选用H2O2造成MES 23.5细胞的损伤模型进行研究。

2，3-吲哚醌(2，3-indolinedione，isatin，ISA)，又名靛红，是近年发现存在于人和动物体内的一种内源性活性因子，具有多种生物学活性。先前我们在多种动物模型证实ISA可提高脑内DA含量［4］，减轻大鼠6-OHDA损毁模型的旋转行为，同时具有抗动脉粥样硬化［5］和抑制肿瘤生长［6］的作用，这些作用与提高细胞的抗氧化作用有密切关系。本文采用MTT、FCM和LSCM方法测定了ISA预处理对H2O2损伤的MES 23.5细胞△ψm和［Ca2+］i水平，以进一步深入探讨ISA保护细胞的可能机制。

1 材料与方法

1.1细胞培养MES 23.5细胞由美国休斯敦贝勒医学院神经科友情馈赠。用含5%胎牛血清的DEME/F12培养基(均购自美国 GIBCO-BRL公司)，在5%CO2、37℃饱和湿度条件下，于铺被了多聚赖氨酸的培养瓶或培养皿中培养。

1.2主要仪器设备CO2培养箱(Thermo Electron Corporation，美国);倒置显微镜(OLYMPUS，日本);低温高速离心机(Eppendorf，德国);酶标仪(雷杜公司，深圳);流式细胞仪(BD Biosciences，美国)，激光扫描共聚焦显微镜(OX-81，Olympus，日本)。

1.3 MTT检测

1.3.1不同浓度H2O2对MES 23.5细胞生长的影响取对数生长期的MES 23.5细胞，用DMEM/F12培养液稀释成6×108cells·L－1的细胞悬液接种于铺有多聚赖氨酸的96孔板，置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后加入不同稀释度的H2O2(5、10、20、40、80 和 160 μmol·L－1)，以新鲜配制的DMEM/F12培养液为阴性对照。

培养结束前4 h，每孔加入5 g·L－1的MTT 20 μl，37℃培养箱中培养4 h，弃上清后每孔加入DMSO 200 μl，自动酶标读数仪比色(主波长494 nm，次波长630 nm)，测定其吸光度值。并计算各组MES 23.5细胞的存活率。细胞存活率/%=实验组吸光度均值/阴性对照组吸光度均值×100%。

1.3.2不同浓度ISA对MES 23.5细胞生长的影响

按上述方法测定不同浓度 ISA(25、50、100、200、400 μmol·L－1)对 MES 23.5 细胞生长的影响，计算细胞存活率。

1.3.3不同浓度ISA对H2O2造成MES 23.5细胞损伤的保护作用相同方法测定不同浓度ISA(25、50、100、200、400 μmol·L－1)对 20 μmol·L－1H2O2造成MES 23.5细胞损伤的保护作用。计算各组细胞存活率。

1.4FCM检测△ψm将MES 23.5细胞悬液接种于铺有多聚赖氨酸的6孔板中，每孔2 ml。24 h后各孔分别加入 H2O220 μmol·L－1、H2O220 μmol·L－1+ISA 100 μmol·L－1和 DMEM/F12 培养液作阴性对照。置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h。

测定△ψm:培养结束前30 min，弃上清，每孔加入5 mg·L－1的 R 123，37℃避光负载 30 min，HBS吹打制成单细胞悬液，200目尼龙网过滤后加入流式细胞仪的样品室，以激发波长488 nm，发射波长523 nm测定，FCS/SSC设门，收集门内10 000个细胞，CELLQuest Pro分析系统分析每组细胞R 123的荧光强度。

FCM分析各组细胞R 123的荧光强度，以荧光强度为101设门，低于101为M1区，高于101为M2区，M1区的细胞认为是△ψm降低，受损细胞所占比例，M2区的细胞为正常细胞所占比例。

1.5LSCM测定［Ca2+］iMES 23.5细胞悬液接种于放置了玻片并铺有多聚赖氨酸的24孔板中。24 h 后各孔分别加入 H2O220 μmol·L－1、H2O220 μmol·L－1+ISA 100 μmol·L－1和 DMEM/F12 培养液作阴性对照。继续培养24 h，培养结束前45 min，每孔加入 Fluo-3/AM 50 μl，37℃ 避光负载 45 min后将玻片放置于LSCM测定小室内，由488 nm激发，检测各组细胞发射波长525 nm处的荧光强度。以Fluoview 5.0图像处理系统分析荧光强度。

1.6统计学处理实验结果以±s表示，应用SPSS11.0软件包进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，Student-Newman-Keuls检验，各组间率的比较进行χ2检验。

2 结果

2.1MTT检测结果5，10 μmol·L－1的 H2O2作用于MES 23.5细胞后，对细胞存活率无影响，20 μmol·L－1及以上浓度的H2O2处理组，细胞的存活率降低(P＜0.01)，且至 160 μmol·L－1范围内，表现出浓度依赖关系。由此在本实验中使用20 μmol·L－1的H2O2造成MES 23.5细胞损伤模型。

单独使用不同浓度的 ISA(25、50、100、200、400 μmol·L－1)对细胞存活率无影响。25 及50 μmol·L－1ISA处理的MES 23.5细胞存活率与单独H2O220 μmol·L－1处理组相比，差异无显著性，ISA 100、200和400 μmol·L－1处理的细胞存活率均较单独H2O220 μmol·L－1组有明显升高(P＜0.01，P＜0.05，Fig 1)。

Fig 1 Protective effect of different concentration of ISA on the viability of H2O2-treated MES 23.5 cells

2.2FCM检测△ψm结果20 μmol·L－1H2O2与MES 23.5细胞共同培养24 h后，M1区细胞所占比例平均为28.8% ±5.4%，表明28.8%的细胞△ψm降低，而对照组为21.3% ±3.3%，两者之间差异明显(P＜0.05);20 μmol·L－1H2O2+ISA 100 μmol·L－1组，M1区细胞所占比例平均为20.1% ±3.2%，比H2O2处理组明显降低(P＜0.01)，完全恢复到正常水平(Fig 2B)。

MES 23.5 细胞经20 μmol·L－1H2O2孵育 24 h后，平均荧光强度为30.0±3.5，较对照组明显降低(46.7 ± 5.3，P＜ 0.01)。20 μmol·L－1H2O2+ISA 100 μmol·L－1组平均荧光强度为 43.0 ±4.7，较单独使用H2O2组明显增强(P＜0.01，Fig 2C)。

Fig 2A Protective effect of ISA 100 μmol·L －1on the △ψm of 20 μmol·L －1H2O2-treated MES 23.5 cell(original figure)

Fig 2B Effect of ISA 100 μmol·L －1on the △ψm of 20 μmol·L －1H2O2-treated MES 23.5 cells

Fig 2C Effect of ISA 100 μmol·L －1on the R 123 fluorescence intensity of H2O2-treated MES 23.5 cells

2.3LSCM检测［Ca2+］i结果20 μmol·L－1H2O2组细胞内荧光强度(160.3±48.9)与对照组(57.3±13.5)相比明显增强(P＜0.01)，表明经H2O2孵育后MES 23.5细胞的［Ca2+］i明显升高;20 μmol·L－1H2O2+ISA 100 μmol·L－1组，荧光强度为83.0±8.2，比H2O2组明显降低(P＜0.01，Fig 3B)。

3 讨论

ISA为吲哚类衍生物，是在人体内发现的内源性生物活性物质［7］，且广泛存在于海洋生物如龙虾和十字花科植物如板蓝根、甘蓝等［8］。

本实验发现单独使用 25 μmol·L－1至 400 μmol·L－1的ISA对细胞存活率无明显影响，而将一定浓度的ISA加入H2O2损伤的MES 23.5细胞后，使存活率增高，表明ISA能拮抗H2O2对MES 23.5细胞造成的损伤。

△ψm是由于线粒体内膜两侧质子的不对称分布而形成的电位差，为维持线粒体正常功能所必需。在细胞受损伤早期，由于线粒体内膜通透性转换管孔 (permeability transition pore，PTP)开放，使膜通透性增加，△ψm下降。△ψm的变化可利用能选择性被线粒体所吸收的荧光染料——R 123来测定，FCM检测细胞荧光强度的变化反映△ψm变化，检测出早期受损伤的细胞［9］。生理情况下PTP周期性开放，以维持线粒体内电化学平衡，保持氧化还原通路的畅通。细胞凋亡过程中，PTP不可逆性开放，导致线粒体内膜两侧离子梯度消失，△ψm降低，呼吸链与氧化磷酸化失偶联，最终引起细胞凋亡［10］。本实验20 μmol·L－1H2O2组 MES 23.5 细胞的 R 123吸收值明显低于对照组，且△ψm降低的细胞所占比例明显增高，即△ψm已发生异常改变。多种原因均能诱导PTP的开放，其中高浓度Ca2+和ROS尤为重要［11］。

Fig 3A Effect of ISA 100 μmol·L －1on the Fluo-3 fluorescence intensity of H2O2-treated MES 23.5 cell(original figure，40 × )

Fig 3B Effect of ISA 100 μmol·L －1on the Fluo-3 fluorescence intensity in H2O2-treated MES 23.5 cells

维持细胞内低浓度的Ca2+是细胞正常与否的一个重要标志，细胞内Ca2+的超负荷是导致细胞变性坏死的重要因素［12］。大量ROS可破坏细胞膜，造成膜通透性增加从而使Ca2+内流增加。ROS还可损伤线粒体膜，导致ATP生成减少，抑制钙泵活性;ROS损伤肌浆网和内质网，影响Ca2+的转运，加剧细胞内 Ca2+超载［13］。

本实验 20 μmol·L－1H2O2孵育 MES 23.5 细胞24 h后，细胞内Fluo-3荧光强度明显升高，表示MES 23.5 细胞［Ca2+］i升高;100 μmol·L－1的 ISA处理后，细胞内Fluo-3荧光强度较H2O2处理组明显降低，表示 ISA处理降低了 MES 23.5细胞［Ca2+］i水平。

线粒体对Ca2+的摄取和释放在胞质钙离子浓度的调节中起重要作用。当［Ca2+］i升高时，线粒体代偿性摄入Ca2+。Ca2+的摄入常伴随线粒体膜的去极化和H+的排出，还有线粒体内Ca2+浓度的增加，当Ca2+摄入过量时，这些因素均促使线粒体内膜PTP开放，其结果线粒体膜对离子通透性升高，Ca2+流入胞质，△ψm降低和氧化磷酸化的脱偶联［14］。

在使用了ISA后，减轻了H2O2对MES 23.5细胞造成的损伤。该保护作用主要通过ISA的抗氧化作用，降低了［Ca2+］i水平，减少PTP的开放，△ψm降低减轻。

本实验中研究的ISA对DA能神经元的保护作用以及对其可能机制的初步探讨，为DA系统功能失调相关疾病的预防与治疗提供新的可能方案，为这一海洋活性物质的新用途和进一步开发提供实验依据。

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