孙运从， 林桂涛， 盛华刚， 王 鹏

(1.山东中医药大学，山东济南 250355)

壳聚糖絮凝沉降法是近几年研究较多的用于中药提取液纯化的方法。相对于常用的乙醇沉淀法有操作简单，节省乙醇，成本低的优点。但此方法在对中医古代经典名方制剂纯化方面研究的较少，为此以炙甘草汤为样本，考察壳聚糖絮凝沉降法的纯化效果，以加强对中医古代经典名方开发的研究。炙甘草汤出自于《伤寒论》，方由炙甘草、生姜、桂枝、人参、生地、阿胶、麦冬、麻仁、大枣组成，用于太阳病心阴阳两虚证的治疗。研究时以处方中活性成分或指标成分为指标，确定壳聚糖絮凝沉降的最佳工艺，比较沉降前后成分损失情况，并与乙醇沉淀法进行比较，实验如下。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC－10A高效液相色谱仪，色谱柱:Kromasil C18(5 μm、4.6 mm × 200 mm)，十万分之一电子天平(梅特勒公司提供)，离心机(LD5－10，北京医用离心机厂)。

1.2 材料 所用试剂均为分析纯或色谱纯;壳聚糖(山东奥康生物科技有限公司提供);无水葡萄糖对照品，人参皂苷Rb1(110704－200318)，甘草酸单铵盐(110731－200614)均购于中国药品生物制品检定所。药材均购自济南建联中药材店，经检验均符合2005年版《中国药典》一部相应品种项下的质量要求。

2 方法与结果

2.1 壳聚糖纯化工艺参数的考察 壳聚糖絮凝沉降法纯化的过程中，提取液浓缩程度、沉降时静置温度、壳聚糖的加入量、沉降液pH值等因素会对纯化效果产生影响［1－3］。为此，以提取液中甘草酸、总多糖、总皂苷的量和浸膏率为指标，采用L9(34)正交试验的方法，考察各因素对纯化效果的影响，以优选出较佳的纯化工艺。考察的因素水平见表1。

表1 因素水平

炙甘草汤提取液的制备:称取炙甘草汤中炙甘草等其余八味药材(阿胶除外)，加22倍量水，煎煮3 h，滤过，滤液浓缩至每1mL相当于生药1 g的药液。

精密量取浓度为1 g生药/mL的药液25 mL、0.50 g生药/mL的药液50 mL、0.25 g生药/mL的药液100 mL，加热至70℃，按正交表中的设计，加1%氢氧化钠溶液调节pH，加相应百分比体积的壳聚糖溶液(壳聚糖加1%醋酸溶液使溶解，制成浓度为1%的溶液)，搅拌20 min，置于相应的温度环境内静置12 h，离心(3 000 r/min)15 min，上清液转移至250 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得。

2.1.1 药液中甘草酸的测定［4］色谱条件:以十八烷基键合硅胶为填充剂;以甲醇－0.2 mol/mL醋酸铵溶液－冰醋酸(67:33:1)为流动相;检测波长为250 nm。

药液中甘草酸的测定:精密量取纯化后的药液15 mL(相当于生药的1.5 g)，蒸干，加流动相20 mL使溶解，定量转移至25 mL量瓶中，超声处理30 min，放冷，加流动相至刻度，摇匀，滤过，续滤液供测定甘草酸。结果见表2。

2.1.2 药液中总皂苷的测定 标准曲线的绘制:精密称取人参皂苷Rb1对照品，加甲醇制成每1 mL含2 mg的溶液，分别精密量取 10、20、40、60、100 μL 置 5 mL 量瓶中，热风挥去溶剂，加5%香草醛冰醋酸溶液0.2 mL、高氯酸0.8 mL，于60℃水浴加热15 min，取出，立即用冷水冷却，加冰醋酸至刻度，摇匀，放置30 min后于550 nm处测定吸收度。结果人参皂苷Rb1对照品在4～40 μg/mL范围内有良好的线性关系，回归方程为:

药液中总皂苷的测定:精密量取纯化后的药液10 mL(相当于1 g生药)，用乙醚提取至乙醚层无色，弃去乙醚液，水层用水饱和正丁醇提取6次，每次20 mL，合并正丁醇提取液，蒸干，残渣加水10 mL使溶解，通过D－101大孔树脂柱(ф1.5 cm×10 cm)，先用水100 mL洗脱，再用20%乙醇100 mL洗脱，弃去水和20%乙醇洗脱液，继用70%乙醇100 mL洗脱，收集洗脱液，蒸干，残渣用甲醇溶解，定量转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取1 mL，按标准曲线项下操作测定，计算含量。结果见表2。

2.1.3 药液中多糖的测定 标准曲线绘制:称取已干燥至恒重的无水葡萄糖对照品，加水制成每1mL含0.35 mg的溶液，精密吸取 0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 mL，分别置于 10 mL具塞刻度试管中，各加水至2.0 mL，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0.2%蒽酮－硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置沸水浴中加热10 min，取出，立即置冰水浴中冷却10 min，取出，以相应试剂按同样处理方法为空白，在585 nm波长处测定吸光度，以吸光度Y为纵坐标，取样量X为横坐标，绘制标准曲线，结果葡萄糖对照品在35～210 μg范围内有良好的线性关系，回归方程为:Y=0.004 5X+0.027，r=0.999 7。

药液中多糖的测定:精密量取纯化后的药液10 mL(相当于1 g生药)，加乙醇调至乙醇浓度为80%，静置12 h，离心(3 500 r/min)30 min，倾去上清液，残渣加80%乙醇25 mL，超声处理10 min，离心，倾去上清液，沉淀加水使溶解，定量转移至50 mL量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密吸取0.5 mL置10 mL具塞刻度试管中，同标准曲线绘制方法进行测定，结果见表2。

2.1.4 药液中浸膏的测定 精密吸取纯化后的药液20 mL(相当于原药材2 g)，置于已干燥至恒重的蒸发皿，蒸干，于105℃烘3 h，取出，置于玻璃干燥器中冷却30 min后称重，计算浸膏率，结果见表2。

表2 壳聚糖纯化条件L9(34)正交考察

2.1.5 结果 由直观分析和方差分析可以看出:①以甘草酸为指标，对絮凝沉降效果影响最大的因素是药液的pH值(P＜0.05)，其次为壳聚糖的加入量，药液的浓度影响较小，但与静置温度等三者均无明显的影响。最佳条件为A1B1C1D3。②以总皂苷为指标，对结果影响最大的因素为药液的浓度(P＜0.05)，而药液的pH值影响最小，但与静置温度、壳聚糖的加入量均无明显影响。最佳条件为A1B3C2D2。③以总多糖为指标，药液的浓度和壳聚糖的加入量对结果影响较大(P＜0.05)，药液的pH值和静置温度对结果影响较小。最佳条件为A1B1C1D3。④各因素对浸膏率的减小的作用接近，最佳条件为A1B1C3D1。⑤综合以上结果，药液的pH值对甘草酸的影响较大，而对其他指标成分影响较小。在pH值较高时，甘草酸的损失量较小。药液浓度对总皂苷和多糖的损失影响较大，浓度高时损失较小，药液浓度对其他指标影响较小;壳聚糖的加入量对多糖影响较大而对其他指标影响较小。随着壳聚糖加入量的增加，多糖损失增大。放置的温度对指标均无明显的影响，因此可以根据实际应用的情况进行选择。

综合以上分析，确定最佳纯化工艺条件为A1B1C1D3。即将药液浓缩至浓度为1.0 g生药/mL，加热至70℃，调药液pH值为6，加入10%的1%壳聚糖醋酸溶液，混匀，静置12 h，滤过，即得。

2.1.6 验证试验 按照确定的工艺进行试验，结果见表3。

表3 验证试验结果

2.2 与乙醇沉淀工艺的比较

2.2.1 乙醇沉淀处理 精密量取原药液30 mL，加乙醇使含醇量达到70%，低温(5℃)冷藏静置12 h，滤过，滤液回收乙醇至无醇味，转移至100 mL量瓶中，加水至刻度，作为乙醇沉淀法供试品溶液。

同时测定未纯化处理的药液中各指标成分的量，并对壳聚糖絮凝沉降药液和乙醇沉淀药液进行比较，结果见表4。

由表4可以看出，壳聚糖纯化法和乙醇沉淀法均能造成

成分的损失，但是两种方法对不同成分的保留量有差异，乙醇沉淀法对甘草酸造成的损失较壳聚糖沉淀法小，而壳聚糖絮凝沉降法对总皂苷和多糖的保留效果比乙醇沉淀法好，以保留成分的总量来看，壳聚糖沉淀法较乙醇沉淀法好。

3 讨论

3.1 由于本方药材中含有较多的多糖、皂苷类成分［5－8］，因此在本实验中选择甘草酸的含量、总多糖、总皂苷和浸膏率为考察指标，优选壳聚糖的最佳澄清工艺。

3.2 两种方法均能造成成分的损失，不同的方法对相同成分的影响不同.在本处方中，对君药炙甘草的活性成分甘草酸的保留效果，乙醇沉淀法较壳聚糖沉淀法好，而壳聚糖絮凝沉降法对总皂苷和多糖的保留效果比乙醇沉淀法好，以保留成分的总量来看，壳聚糖沉淀法较乙醇沉淀法好。一般情况下，纯化工艺均会对有效成分的转移率产生影响，好的纯化工艺应是相对较多保留有效成分。因此壳聚糖澄清剂可以用于炙甘草汤提取液的纯化。

3.3 中药复方制剂的药效不仅与有效成分或指标成分的含量有关，也与成分之间的组成比例有密切的关系，成分比例的不同能够造成制剂作用性质的较大的差异。本实验表明，原药液(未经乙醇沉淀或壳聚糖沉淀的药液)中三类成分之间的比例为:甘草酸－总皂苷－总多糖=61∶82∶1，乙醇沉淀法为:292∶113∶1，壳聚糖沉淀法为:52∶53∶1。由此可见，无论是乙醇沉淀法还是壳聚糖沉淀法均造成原药液中成分之间比例的改变，因而，亦可能造成药效性质的改变。

［1］王海宁，谢印芝，樊飞跃.壳聚糖及ZTC1+1－Ⅱ澄清剂对大青叶提取液的澄清工艺研究［J］.中国药房，2008，19(21):1625－1628.

［2］刘 益，王玉蓉，许文博.壳聚糖絮凝沉淀法在牛膝纯化工艺中的应用性研究［J］.中国中药杂志，2008，33(7):825－828.

［3］彭智聪，张少文，刘德焱等.壳聚糖用于清热解毒口服液澄清工艺的探讨［J］.中成药，2000，22(4):299－300.

［4］中国药典［S］.一部.2005:59.

［5］倪慕云，边宝林.地黄化学成分的研究概况［J］.中国中药杂志，1989，14(7):4l－43.

［6］国家中医药管理局中华本草编委会.中华本草［M］.北京:上海科学技术出版社，1996:1143.

［7］易进海.麦冬研究进展［J］.华西药学杂志，1993，8(1):32－38.

［8］芮春兰.国内对甘草化学成分的研究进展［J］.中国校医，2006，20(1):105－106.