程超华，李育君，赵立宁，唐 蜻，臧巩固

（中国农业科学院麻类研究所，长沙 410205）

大麻（Cannabis sativa）为大麻科大麻属一年生草本植物，按其用途分为工业大麻、油用大麻和药用大麻三类。工业大麻相关产品可用于造纸、化妆品、服装、地毯、汽车、建筑、农业、回收、食品等领域，多功能性使其在市场上有很强的竞争优势；油用大麻和药用大麻也因其独特性分别在食品和医药领域占有重要地位。大麻一般是雌雄异株，为异质结合体，同一群体内不同个体间表现多样性，遗传基础复杂，其育种进程远落后于其它植物。因此，利用生物技术手段对传统育种方法进行改良和辅助，是推进大麻育种的有效方法。

离体培养是生物技术工作的基础，目前大麻离体培养研究均采用野外生长的实生苗作为外植体。大麻生长周期短，外植体取材时期有限且难以消毒灭菌，是离体培养研究的瓶颈[4，6，7]。健壮的无菌苗是有效开展转基因研究及其它组培实验的基础和关键。种子是获得大麻无菌苗的主要途径之一，因此，种子灭菌显得尤为重要。但是，大麻种子结构复杂，内部携带大量的微生物，种皮坚硬，自然破壳萌芽时间长，波兰研究者曾试验用种子无菌苗获得外植体，但因种子内生菌多，污染严重而放弃[10]。目前未见高效获取大麻种子无菌苗研究的报道。本研究以大麻种子为材料，进行多种方法的灭菌处理，获得了出苗率高、污染少的种子无菌苗培养方法，为大麻组织培养和遗传转化研究打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

供试品种为尤纱31，皖大麻，山西本地麻2号、汾麻3号。分别来自黑龙江和山西。

1.2 灭菌方式

选取饱满、匀实种子，经三个步骤进行种子灭菌处理：

（1）用98%工业硫酸浸泡20min后，于自来水下冲洗30min；

（2）用75%酒精浸洗2min；

（3）经下述四种不同方式进行处理，接种于MS培养基上：

① 0.1%深汞浸泡20min后，用无菌水冲洗数次，于干净滤纸上吸干水分，用手术刀和镊子剥去种皮，接种于培养基上。

② 0.1%深汞浸泡20min后，用无菌水冲洗数次，于干净滤纸上吸干水分，不剥种皮直接接种于培养基上。

③ 3%次氯酸钠浸泡20min后，用无菌水冲洗数次，于干净滤纸上吸干水分，用手术刀和镊子剥去种皮，接种于培养基上。

④ 3%次氯酸钠浸泡20min后，用无菌水冲洗数次，于干净滤纸上吸干水分，不剥种皮直接接种于培养基上。

每一处理30个外植体，重复3次，3天后每天统计污染率和种子萌发情况。

为了试验不同品种对灭菌处理的反应，分别取皖大麻，山西本地麻2号、汾麻3号按照处理③进行灭菌处理，3天后统计污染率与种子萌芽情况。

1.3 试验结果的统计方法

参考王子成的方法[5]：

污染率=（污染外植体数/接种外植体数）×100%；

未萌芽率=［（死亡个数+未萌芽数）/接种外植体数］×100%；

成功率=（萌芽不污染数/接种外植体数）×100%

这里，用未萌芽率代替杀死率，更能反映灭菌的负面影响。因为有一部分外植体虽未被杀死，但由于受到的伤害也较重，不能萌发，因而也不能进行继续培养。所得数据用邓肯氏新复极差法分析。

2 结果与分析

2.1 不同灭菌方法对污染率及种子萌发的影响

接种1天后，剥皮处理（③和①）的种子开始萌发，到第3天时长势良好，可见深绿色子叶及小部分真叶，是用作组织培养的极佳材料，3天后萌发未见增多，可见3天是种子萌发生长及外植体取材的最佳时期。未剥皮处理（②和④）的种子则萌发启动时间长，一周后才开始突破种皮，第10天时可见子叶和真叶。10天后萌发率未见增加。表1的结果表明，处理③的灭菌效果最好，成功率达到80.83%，污染率只有4.17%。处理①的成功率和污染率均显著低于处理③，这可能是因深汞不能充分浸入种子内部对其内生菌进行灭杀。而且有可能己对种子内部造成伤害，影响其萌芽。处理②和④污染率极低，但因其萌发时间长，出芽率低。不适合用作获取无菌苗。由上可见，处理③的消毒方法，即3%的次氯酸钠处理种子后剥去种皮接种于培养基上，灭菌效果好，污染少，成功率高，是获取无菌苗的最佳消毒方法。

表1 不同灭菌方法得到无菌苗的情况Table 1 Results ofdifferent hemp seeds with different disinfection protocols

2.2 种皮留存对污染率及种子萌发的影响

从表1可知，处理④和处理②的灭菌处理分别与③、①相同，但均未剥种皮接种于培养基上，虽然污染率极低，但出芽时间长且出芽率低。这是由于大麻种壳坚硬，培养基的理化条件不适合其自然萌芽，其在培养基中的萌芽时间明显高于田间条件。对于要求快速、大量无菌苗作外植体的离体培养来说，超净台上剥去种皮虽然较难操作，但出苗时间和出苗数量却明显好于不剥种皮。

2.3 不同大麻品种污染率的差异

表2的结果表明，在用处理③的方法对不同品种大麻种子进行灭菌处理时，不同品种间的成功率和污染率存在着一定的差异，这可能与不同品种种子外表皮结构和内生菌携带量有关，也可能与不同材料对次氯酸钠的耐受力有关。皖大麻经灭菌以后，成功率最小；其它品种，经灭菌后均有较高的成功率，其中汾麻3号最高，达到87.78%。所以，在对污染率较高的大麻品种进行灭菌处理时，可对现有方法进行适当改进调整，或者每瓶培养基尽量少接种种子，避免交叉污染，以便获得更好的成功率。

表2 不同品种得到无菌苗的情况Table 2 Difference amonghemp cultivars on gaininggermfree seedlings bythree-step treatment

3 讨 论

植物组织的离体培养技术是转基因育种和体细胞突变技术育种的前提和基础。种子无菌苗因能大量、便捷地产生离体培养所需的外植体（子叶、真叶、下胚轴）而被广泛应用。因此，如何成功的对种子灭菌，缩短萌芽时间，获得大量无菌苗，是进行生物技术研究的前提。

种子消毒方法得当与否是获得无菌苗的关键，由于作物种子在其生长发育过程中易受自然界各种细菌和真菌的浸染，种子不仅表面带菌，而且内部也可能被感染，所以对种子进行彻底的灭菌就非常重要。

一般常用的灭菌剂有：75%酒精、0.1%升汞、3%-4%次氯酸钠等，其它抗菌素、双氧水、硝酸银、溴水等亦可采用。升汞是应用最广泛的一种消毒剂，它杀菌力强，但刺激性和腐蚀性大，对金属器皿有腐蚀作用，对人畜有剧毒。对细菌的渗透性小，遇有机物效果降低。升汞消毒后难以除去残余汞对外植体的杀伤作用；而次氯酸钠灭菌的原理是水解形成次氯酸，次氯酸再进一步分解形成新生态氧，新生态氧的极强氧化性使菌体和病毒上的蛋白质等物质变性，从而使病源微生物致死[3]。

迄今各种灭菌方法已有不少报道：如杜燕等曾对贮存过期油菜种子进行消毒处理研究，结果以10%NaClO处理较好[1]。张志飞等研究表明，适用于富含内生真茵的高羊茅种子的最佳消毒组合为50℃温水浸泡10 min．再经70%酒精处理5 min．然后用次氯酸钠处理15 min，在保证较高种子发芽率的前提下，可降低种子污染率，提高出愈率[8]。

本研究中，大量易获取的、不受取材时间限制的无菌苗为大麻组织培养提供了良好的基础，该体系下获得的无菌苗可以直接作为组织培养的外植体来源，无需进行再次消毒，我们的初步试验表明，将这些外植体直接接种在培养基上可诱导出愈伤组织。

本研究建立的新的灭菌方法的优点在于：一、用次氯酸钠作为灭菌剂，处理以后残毒能够自然降解，避免了对环境的污染，因而优于用升汞处理；二、用工业硫酸预处理种子，除去种子上附着的杂质，减少污染机率，软化后种皮有利于下一步的剥皮操作。三、种子经灭菌处理后，于超净台上人工剥去种皮，能大大加快种子萌芽速度，3-4天时间便能生产大批量无菌苗，快捷方便。至今，还没有该方法的报道，我们将该方法命名为“三重处理法”。本研究建立的“三重处理法”不但解决了大麻种子灭菌不易的难题，而且对其它难灭菌材料，特别是种子坚硬，内生菌较多的种子的灭菌，也有一定的参考价值。但应该指出的是，不同种类的植物材料，同一植物不同成熟程度的材料，对灭菌剂的耐受力不同，在进行灭菌处理时，应该根据具体情况，决定灭菌处理的时间，以获得较高的成功率[2]。

[1] 杜燕.蒋海玉.刘其宁.贮存过期油菜种子消毒方法的研究[J].种子，2003（02）：39-40.

[2] 胡凯，张立军，自雪梅，等．植物组织培养污染原因分析及外植体的消毒[J]．安徽农业科学，2007，35（3）：680-681．

[3] 唐琳，刘建国，马欣荣．两种灭菌方法对番茄种子灭菌效果的评价[J]．种子，2008，27（9）：17-18．

[4] 佟金风，高南，李凝，等.大麻试管苗生根培养基的优化[J].安徽农业科学，2008，36（33）：14438-14440.

[5] 王子成，李忠爱，邓秀新.柑橘成年态茎段外植体消毒方法研究[J].河南大学学报（自然科学版），2005，35（2）：58-59.

[6] 尹品训，杨明，郭鸿彦，等.大麻的离体培养与快速繁殖.西南农业学报[J]，2005，18（4）：503-505.

[7] 尹品训，杨明，郭鸿彦，等．大麻组织培养中玻璃化苗研究初报[J].云南农业科技，2004（4）：12.

[8] 张志飞，饶力群.高羊茅种子内生真菌的消毒方法[J].草业科学，2008，25（6）：93-97.

[9] 张志元，官春云.油菜无菌苗培养前的种子消毒技术[J].中国油料作物学报，2005，（1）：88-91.

[10] Aurelia Slusarkiewicz-Jarzina，etc.ACTA BIOLOGICA CRACOVIENSIA Series Botanica[J].Influence of cltivar，explant source and plant growth regulator on callus induction and plant regeneration ofcannabis sativa L.2005，47（2）：145-151.