异叶败酱有效部位PHEB抗肿瘤作用研究

2011-05-12仇凤梅张如松

亚太传统医药 2011年7期

仇凤梅，杨波，李娜，张如松

（浙江中医药大学药学院，浙江杭州 310053）

异叶败酱（Patrinia sp.）为败酱科败酱属多年生草本植物，药用其根［1］，有消肿排脓、祛瘀止痛的功效，临床上用于治疗急性阑尾炎初起、瘰疬、无名肿痛、宫颈糜烂、跌打损伤、骨折等症［2］。现代药理研究表明［3－4］，异叶败酱不同提取物对体内外肿瘤癌细胞有强杀伤作用，但未见报到其对B16和C6肿瘤细胞的作用。我们从异叶败醤中分离纯化得到抗肿瘤的有效部位PHEB，通过体外抗肿瘤实验，明确PHEB对B16和C6肿瘤细胞的抑制作用。

1 实验材料

1.1 细胞株及培养条件

C6细胞由浙江省医学科学院药物研究所提供；B－16细胞由浙江中医药大学资源鉴定实验室提供。B－16细胞接种于RPMI－1640培养基中；C6细胞接种于DMEM培养基中；两者均于37℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中培养，细胞长满瓶底近80%后用PBS清洗，以0.25%胰酶消化3～5min，转移至离心管，1000rpm离心3min，弃上清液，适量培养基混悬吹打成单细胞悬液进行传代。加药均在细胞对数生长期内进行。

1.2 药物

PHEB，由本实验制备，用DMSO配制为10g／L的贮存液，实验前用RPMI－1640培养基稀释至所需浓度；RPMI－1640培养基：554362，Invitrogen公司。新生小牛血清：080304，杭州四季青生物工程材料研究；0.25%胰蛋白酶：1299A77，上海生工公司，进口分装；DMEM 培养基：397753，Invitrogen公司；MTT（四甲基偶氮唑盐）：3154B79，杭州昊天生物技术有限公司，进口分装。

1.3 仪器

Thermo Forma 991超低温冰箱，美国Thermo电子公司；Thermo Forma 3111细胞（CO2）培养箱，美国 Bio－Tech公司；Air Tech超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；OLYMPUS CKX41SF倒置生物显微镜，日本Olympus公司；BIO－RAD 680酶标仪，日本BIO－RAD公司。

2 方法

2.1 PHEB的制备

取异叶败酱干燥根茎19.5kg，粉碎成粗粉，加80%乙醇浸泡48h后，装入渗漉缸，收集渗漉液，渗漉液回收乙醇至无醇味，得到浸膏。浸膏加适量乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液并回收溶剂，得到乙酸乙酯提取物（PHE）1040g。取250g乙酸乙酯提取物，进行硅胶柱层析分离，用不同浓度比例二氯甲烷－乙酸乙酯梯度洗脱，分离得到4个流分PHE（A、B、C、D）。其中二氯甲烷－乙酸乙酯（10∶1）50L洗脱后，得到18.8g黄色油状物质（PHEB）。

2.2 PHEB体外抗肿瘤实验

取对数生长期的B－16和C6细胞，0.25%胰蛋白酶消化，转移至离心管离心，弃上清液，加入新的适量RPMI1640或DMEM培养基吹成单细胞悬液；根据不同细胞生长速度，以适宜的细胞数接种于96孔板上，置于CO2培养箱中培养24h。然后分别加入5组浓度呈等比递减的PHEB（最大给药浓度60μg／mL）。设正常对照组（加肿瘤细胞，不加PHEB）和空白孔（不加肿瘤细胞和PHEB），使每孔总体积为200μL，各设3个复孔。继续在CO2培养箱中培养72h后，倒置显微镜下观察不同浓度的PHEB对肿瘤细胞的影响；加入MTT继续培养至少4h后，弃去孔内培养上清液，加入DMSO溶解，震荡混匀后，在酶标仪上570nm波长处测定OD值，作为存活细胞个数的相对值。实验重复3次。用82798－IC50计算软件计算IC50，并计算95%可信限区间。

按下列公式计算抑瘤率：

3 数据统计

4 结果

从异叶败醤醇提物中分离精制得到PHEB（4.0‰）。结果表明，PHEB对B－16和C6肿瘤细胞均有一定的抑制作用（详见表1），且抑制率都随着给药浓度的增大而增强，具有明显的量－效关系（详见图1）。

表1 PHEB作用72h对肿瘤细胞的抑制作用（，n＝3）

瘤株 IC50（μg／mL） 95%可信限区间（μg／mL）B－16 33.5±3.70 24.53，43.87 C6 41.2±3.50 32.71，50.29

5 讨论

恶性肿瘤（以下简称肿瘤）是严重威胁人类健康的一类常见疾病，其死亡率仅次于心脑血管疾病。因此，寻找有效新药仍然是急需解决的问题。中药作为抗肿瘤药，具有有效成分种类多、抗瘤谱广、副作用小等特点。为寻找中药异叶败酱抗肿瘤作用有效成分，本实验采用MTT法考察发现PHEB对B－16和C6肿瘤细胞均具有一定的细胞毒作用，且具有一定量－效关系。通过研究，将进一步丰富异叶败酱抗肿瘤谱，且为研究异叶败酱抗肿瘤有效成分打下基础。